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重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG休眠菌的促生长作用 被引量:4
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作者 郭晓雅 师长宏 +3 位作者 史皆然 张海 赵勇 邵成 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期919-922,共4页
目的观察重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG的促生长作用。方法将测序正确的Rv2450c基因克隆到表达载体pET32a(+)中,获得RpfE蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的蛋白分别与结核病人血清,Rpf单抗和Rpf结构域单抗进行Wes... 目的观察重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG的促生长作用。方法将测序正确的Rv2450c基因克隆到表达载体pET32a(+)中,获得RpfE蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的蛋白分别与结核病人血清,Rpf单抗和Rpf结构域单抗进行Western blot分析。分别将10pmol/L和100pmol/L的RpfE加入到休眠BCG的培养基中,观察RpfE蛋白对BCG的促生长作用。结果得到融合组氨酸残基的重组RpfE蛋白,Western blot结果显示该蛋白分别与活动期结核病人血清,Rpf单抗和Rpf结构域单抗在40kDa处发生反应。100pmol/L的RpfE蛋白对BCG休眠菌具有明显的复苏和促生长作用。结论构建了MtbRv2450c基因的重组表达载体,纯化获得了RpfE重组蛋白,该蛋白对BCG休眠菌具有复苏和促生长作用。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 rpfe 休眠菌 促生长作用
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复苏因子E-DNA疫苗对BALB/C小鼠免疫效应的研究 被引量:4
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作者 邢爱英 刘忠泉 +7 位作者 贾红彦 李自慧 郑晓静 曹廷明 杜风娇 杜博平 古淑香 张宗德 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2010年第23期4259-4261,共3页
目的:探索复苏因子E(RpfE)-DNA疫苗的小鼠免疫效果。方法:利用真核表达载体PCDNA3.1构建PCDNA3.1-RpfE重组质粒。将SPF级BALB/C小鼠随机分为5组,即空质粒组、RpfE质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组,于0、3、6周先后3次免疫小鼠,在... 目的:探索复苏因子E(RpfE)-DNA疫苗的小鼠免疫效果。方法:利用真核表达载体PCDNA3.1构建PCDNA3.1-RpfE重组质粒。将SPF级BALB/C小鼠随机分为5组,即空质粒组、RpfE质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组,于0、3、6周先后3次免疫小鼠,在第3次免疫后3周,心脏取血ELISA方法检测血清RpfE IgG抗体效价、干扰素γ(IFNγ)水平;并行脾淋巴细胞培养,以RpfE蛋白刺激淋巴细胞,CCK-8法检测淋巴细胞增殖指数、ELISA方法检测上清诱导IFNγ和白介素12(IL-12)产生水平,乳酸脱氢酶试验检测小鼠脾细胞毒性T淋巴(CTL)杀伤效应。结果:(1)RpfE质粒组小鼠血清中RpfE抗体水平明显高于其他各组(P<0.001);RpfE质粒组IFNγ水平明显高于空质粒组、生理盐水组、空白对照组和BCG组(P<0.01或P<0.05)。(2)RpfE质粒组具有较强的刺激淋巴细胞增殖作用,CCK-8实验表明其增殖指数高于其他各组(P<0.05);上清ELISA检测表明IFNγ和IL-12产生水平也高于其他各组(P<0.05)。(3)RpfE质粒组脾淋巴细胞特异性CTL杀伤性与其他各组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:RpfE-DNA疫苗可诱导小鼠的免疫应答,具有良好的体液和细胞免疫原性。 展开更多
关键词 疫苗 DNA rpfe 免疫
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Expression,purification and characterization of Mycobacterium tuberculosis RpfE protein 被引量:2
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作者 Ying Xue Yinlan Bai +4 位作者 Xue Gao Hong Jiang Limei Wang Hui Gao Zhikai Xu 《The Journal of Biomedical Research》 CAS 2012年第1期17-23,共7页
Resuscitation promoting factor E (RpfE) is one of the five Rpf-like proteins in Mycobacterium tuberculos& (M. tuberculosis). These Rpf-like proteins are secretory, which make them candidates for recognition by th... Resuscitation promoting factor E (RpfE) is one of the five Rpf-like proteins in Mycobacterium tuberculos& (M. tuberculosis). These Rpf-like proteins are secretory, which make them candidates for recognition by the host immune system. In this study, the RpfE gene was amplified from M. tuberculosis, cloned into the expression vectors pDE22 and pPRO EXHT, and were expressed in Mycobacterium vaccae (M. vaccae) and Escherichia coli DHSa, respec- tively. Both recombinant RpfE proteins were purified by Ni-Sepharose affinity chromatography, and were given to C57BL/6 mice. The RpfE proteins elicited T cell proliferation, and stimulated the production of gamma interferon (IFN-y), interleukin-10 (IL-10) and IL-12. Our results indicated that the RpfE protein expressed in M. vaccae could more efficiently stimulate cellular immune response, making it a promising candidate as a subunit vaccine. 展开更多
关键词 resuscitation-promoting factor rpfe PURIFICATION Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium vaccae
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分枝杆菌噬菌体重组体TM4-RpfE的构建
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作者 杜丽娟 杨婷 +4 位作者 徐莉 邢爱英 刘忠泉 张宗德 郭述良 《上海交通大学学报(医学版)》 CSCD 北大核心 2017年第7期930-935,共6页
目的·构建分枝杆菌噬菌体(TM4)与复苏促进因子(Rpf)的重组体(TM4-RpfE),为联合抗结核药物实现杀灭结核休眠菌、缩短结核化疗疗程奠定实验基础。方法·电转化法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,制备重组工程菌;提取TM4基因组DNA;重... 目的·构建分枝杆菌噬菌体(TM4)与复苏促进因子(Rpf)的重组体(TM4-RpfE),为联合抗结核药物实现杀灭结核休眠菌、缩短结核化疗疗程奠定实验基础。方法·电转化法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,制备重组工程菌;提取TM4基因组DNA;重叠PCR扩增目的融合基因hsp60-RpfE,多步重叠PCR扩增插入长片段HHRH(homologous+hsp60-RpfE+homologous);电转化法将噬菌体DNA与插入长片段HHRH共同转入重组工程菌,挑取单噬菌斑进行PCR和测序验证;SDS-PAGE分析重组噬菌体的蛋白表达。结果·重叠PCR扩增出全长901 bp大小的目的融合基因hsp60-RpfE和1 873 bp大小的插入长片段HHRH;PCR验证重组后的噬菌斑,分别在955 bp和301 bp处出现特异性条带;SDS-PAGE分析显示重组型噬菌体在21 000处出现特异性蛋白条带。结论·分枝杆菌噬菌体重组体TM4-RpfE构建成功,初步验证目的基因RpfE得到表达。 展开更多
关键词 分枝杆菌噬菌体 噬菌体重组 rpfe pJV53质粒 潜伏结核感染
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结核分枝杆菌RpfE蛋白的原核表达及鉴定 被引量:4
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作者 孙林 霍如松 +2 位作者 李求春 潘志明 焦新安 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期1-4,共4页
以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增复活促进因子E(rpfE)基因,并将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,重组表达质粒pET32a-rpfE转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示目的蛋白在细菌裂解上清和沉淀中均有表达,进一步... 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增复活促进因子E(rpfE)基因,并将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,重组表达质粒pET32a-rpfE转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示目的蛋白在细菌裂解上清和沉淀中均有表达,进一步对可溶表达的蛋白通过镍柱亲和纯化,获得高纯度的重组蛋白。Western-blotting试验结果表明:重组RpfE蛋白能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。这为探索RpfE蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制等奠定基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 rpfe蛋白 原核表达 鉴定
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结核分枝杆菌复苏因子E的真核表达及鉴定
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作者 刘忠泉 邢爱英 +7 位作者 贾红彦 李自慧 郑晓静 曾庭明 杜风娇 杜博平 古淑香 张宗德 《结核病与胸部肿瘤》 2010年第3期168-173,共6页
目的构建结核分枝杆菌复苏因子ENN的真核表达质粒。方法PCR扩增结核分枝杆菌复苏因子E基因片段。将片段克隆至PcDNA3.1(-)载体,重组质粒测序正确后,转染至CHO细胞中,表达复苏因子E蛋白质。RT—PCR检测克隆基因mRNA在真核细胞中的... 目的构建结核分枝杆菌复苏因子ENN的真核表达质粒。方法PCR扩增结核分枝杆菌复苏因子E基因片段。将片段克隆至PcDNA3.1(-)载体,重组质粒测序正确后,转染至CHO细胞中,表达复苏因子E蛋白质。RT—PCR检测克隆基因mRNA在真核细胞中的表达,收集并纯化表达的蛋白质,SDS—PAGE分析和Westenblot分析检测目的蛋白的表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)鉴定表达蛋的免疫原性。结果成功构建了结核分枝杆菌复苏因子E基因的真核表达质粒。RT—PCR证实克隆基因mRNA在真核细胞中表达,SDS-PAGE分析和Westenblot分析均证实目的蛋白在真核细胞中成功表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)进一步证实了表达蛋白具有免疫原性。结论我们成功地构建了复苏因子E真核表达系统。 展开更多
关键词 真核表达 复苏因子E 中国仓鼠细胞
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