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Red同源重组技术研究进展 被引量：22
1
作者 韩聪 张惟材 游松 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2003年第12期17-21,共5页
伴随着分子生物学的发展 ,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成 :Exo蛋白是一种核酸外切酶 ,结合在双链DNA的末端 ,从 5′端向 3′端降解DNA ,产生 3′突出端 ;Beta蛋白... 伴随着分子生物学的发展 ,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成 :Exo蛋白是一种核酸外切酶 ,结合在双链DNA的末端 ,从 5′端向 3′端降解DNA ,产生 3′突出端 ;Beta蛋白结合在单链DNA上 ,介导互补单链DNA退火 ;Gam蛋白可与RecBCD酶结合 ,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短 ( 4 0～ 60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作 ,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外 ,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上 ,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行 。 展开更多
关键词 red同源重组 基因打靶 基因工程 red重组酶
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Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用 被引量：12
2
作者 李鑫 李亚芯 戴建君 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第7期1934-1940,共7页
基因敲除是研究基因功能最直接的方法。对于大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)而言,传统的基因敲除方法是利用其原有的RecA系统,此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点,且所需同源臂长,操作复杂。Red同源重组法的出现使得基因组的改... 基因敲除是研究基因功能最直接的方法。对于大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)而言,传统的基因敲除方法是利用其原有的RecA系统,此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点,且所需同源臂长,操作复杂。Red同源重组法的出现使得基因组的改造更为快速、简单,在E.coli基因敲除中的应用也愈加广泛和成熟。作者介绍了Red同源重组系统的组成和同源重组原理,阐述了常用的两步同源重组法敲除E.coli基因的操作步骤及注意事项。大肠杆菌的两步法基因敲除技术已在工程菌改造、病原菌致病机理、耐药机制研究等领域做出巨大贡献,由于两步法仍保留有Red同源重组系统电转效率低、有序列残留的缺陷,作者对几个针对两步法的经典的无痕化改造进行了总结介绍,通过对以上方法及应用进行综述,为以大肠杆菌作为工程菌的基因敲除技术提供参考。 展开更多
关键词 大肠杆菌 red同源重组 基因敲除 两步法
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Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用 被引量：9
3
作者 吕沈聪 赵颖颖 钟卫鸿 《化学与生物工程》 CAS 2013年第6期1-6,共6页
大肠杆菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指... 大肠杆菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势。 展开更多
关键词 大肠杆菌 red同源重组 基因敲除
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细菌λ Red重组技术的应用及其影响因素 被引量：9
4
作者 付喜爱 张德显 +3 位作者 周维 于立辉 田春莲 刘明春 《动物医学进展》 北大核心 2015年第1期91-95,共5页
由λ噬菌体的exo、beta、gam 3个基因分别编码的Exo、Beta和Gam蛋白组成λRed同源重组系统。λRed重组是细菌靶基因置换的有效技术,该技术发展迅速,已广泛应用于大肠埃希菌等细菌染色体DNA的基因敲除、基因整合,可以对任何大小的DNA分... 由λ噬菌体的exo、beta、gam 3个基因分别编码的Exo、Beta和Gam蛋白组成λRed同源重组系统。λRed重组是细菌靶基因置换的有效技术,该技术发展迅速,已广泛应用于大肠埃希菌等细菌染色体DNA的基因敲除、基因整合,可以对任何大小的DNA分子进行精确修饰。利用λRed重组系统不仅可以构建工程菌,还可以为研究细菌的致病机理和耐药机制提供新的方法。然而,许多应用因重组频率而受到限制,影响重组频率的因素主要有底物浓度、同源片段的长度、内源性核酸酶、错配蛋白等。论文综述了λRed同源重组技术的应用进展及影响重组的因素,以期为优化重组试验方案及提高试验的成功率提供帮助。 展开更多
关键词 λ red同源重组 应用 底物 内源性核酸酶 错配蛋白
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利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌 被引量：6
5
作者 闫继爱 张雪 +3 位作者 张芸 左佃光 陈宁 温廷益 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期79-84,共6页
利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通... 利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065L-苏氨酸的产量为5.55±0.51g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065L-苏氨酸产量为9.77±1.83g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065L-苏氨酸产量为8.65±1.42g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L-苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌 red同源重组 基因敲除 L-苏氨酸 发酵
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应用基因敲除快速构建大肠杆菌突变体改造脂肪酸代谢途径 被引量：8
6
作者 曲璟秋 刘翠花 +2 位作者 刘伟丰 陶勇 朱坤 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期608-614,共7页
【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.col... 【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.coli MG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除。【结果】获得了大肠杆菌β-氧化途径的缺失菌株△fadD、△fadE和△fadD-△fadE;脂肪酸合成途径缺失菌株△fabH、△fabF和△fabH-△fabF。敲除fadD和fadE对生长情况没有影响;敲除fabH后,生长速度明显减慢;敲除fabF对生长几乎没有影响。FadD、FadE及双敲缺失体的脂肪酸含量18.2 mg/L、20.0mg/L和19.2 mg/L,略高于野生型17.5 mg/L;FabH、FabF及双敲缺失体的含量分别为12.6 mg/L、15.2 mg/L和11.2 mg/L,明显低于野生型。【结论】在单基因突变体文库基础上,利用P1噬菌体转导、Red同源重组和抗性基因消除进行基因敲除,简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。 展开更多
关键词 大肠杆菌 red同源重组 P1噬菌体 基因敲除 脂肪酸含量
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产D-乳酸重组大肠杆菌ptsG基因的敲除及其混合糖同步发酵 被引量：7
7
作者 丁小云 顾健健 +3 位作者 王永泽 赵锦芳 王金华 赵筱 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期221-226,共6页
为构建能够同时高效利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的重组大肠杆菌工程菌,以能高效利用五碳糖发酵产D-乳酸的大肠杆菌工程菌E.coli JH13为出发菌株,通过Red同源重组技术敲除葡萄糖跨膜转运基因pts G。实验结果表明,pts G缺陷菌株E.coli... 为构建能够同时高效利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的重组大肠杆菌工程菌,以能高效利用五碳糖发酵产D-乳酸的大肠杆菌工程菌E.coli JH13为出发菌株,通过Red同源重组技术敲除葡萄糖跨膜转运基因pts G。实验结果表明,pts G缺陷菌株E.coli JH15在10%混合糖(5%葡萄糖和5%木糖)培养基中发酵,可同时利用五碳糖和六碳糖以完成发酵;而对照菌葡萄糖消耗完才利用木糖,发酵结束还有18 g/L木糖残留;JH15乳酸产量为83.04 g/L,相比于对照菌株提高了25.86%;在稻草秸秆水解液中发酵,JH15同时利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖,乳酸产量为25.15 g/L,转化率为86.42%。JH15作为能利用混合糖同步发酵产D-乳酸的大肠杆菌工程菌,它的成功构建为利用廉价的木质纤维素水解物为原料发酵生产D-乳酸提供参考依据。 展开更多
关键词 重组大肠杆菌工程菌 D-乳酸 ptsG基因 red同源重组 混合糖
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大肠杆菌外膜蛋白ompW基因敲除菌的构建及其对两种抗生素的敏感性 被引量：7
8
作者 吴贤斌 邹海杰 +2 位作者 田丽花 潘建义 赵辅昆 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1021-1026,共6页
探讨大肠杆菌ompW基因敲除后,硫酸新霉素和氨苄青霉素对敲除菌最低抑菌浓度(MIC)和生存率的影响,进而分析OmpW的功能。【方法】运用Red重组技术将大肠杆菌K12染色体上基因ompW敲除,构建缺陷株ΔompW。然后分别测定硫酸新霉素和氨苄青霉... 探讨大肠杆菌ompW基因敲除后,硫酸新霉素和氨苄青霉素对敲除菌最低抑菌浓度(MIC)和生存率的影响,进而分析OmpW的功能。【方法】运用Red重组技术将大肠杆菌K12染色体上基因ompW敲除,构建缺陷株ΔompW。然后分别测定硫酸新霉素和氨苄青霉素对正常菌和ΔompW菌的最小抑菌浓度(MIC)及次抑菌浓度(1/2 MIC)下K12和ΔompW菌的生存率。【结果】经PCR鉴定和通过提取膜蛋白进行western blot分析表明,成功获得ompW敲除菌。抗生素分析表明,K12菌对硫酸新霉素的MIC为8.0μg/mL,生存率为98.0%;ΔompW菌对新霉素的MIC为1.7μg/mL,而其生存率仅为39.0%。而k12对氨苄新霉素的MIC为16.0μg/mL,ΔompW为3.3μg/mL;1/2 MIC下K12生存率为70.4%,而ΔompW为30.3%。【结论】ompW基因缺陷株对两抗生素的敏感性大大增强,表明ompW在细菌抗性方面起着关键作用。 展开更多
关键词 red同源重组 外膜蛋白 OmpW 最小抑菌浓度 生存率
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表达PEDV S蛋白重组PRV的构建与生物学特性评价
9
作者 侯晓璇 穆永 +4 位作者 王同燕 颜世君 王孟月 谭菲菲 田克恭 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期657-663,共7页
将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株的S胞外区基因克隆至含有gG基因上、下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒pUC-ABK中,构建供体质粒pUC-ABK-S,获得线性同源重组片段AS-K-B。利用Red同源重组技术将线... 将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株的S胞外区基因克隆至含有gG基因上、下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒pUC-ABK中,构建供体质粒pUC-ABK-S,获得线性同源重组片段AS-K-B。利用Red同源重组技术将线性同源重组片段电转化至含有pPRVBac-GFPTK-gE-gI-11k-28k-的感受态中获得重组pPRVBac-S,最后拯救获得重组病毒rPRV-S。PCR及IFA鉴定结果显示,S胞外区基因成功转录且表达,生物学特性评价结果表明重组病毒能够稳定遗传,为研制猪流行性腹泻病毒活载体疫苗提供了思路。 展开更多
关键词 PEDV S蛋白 red同源重组 重组PRV
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基因敲除技术研究进展 被引量：6
10
作者 丁海峰 李小申 +1 位作者 黄慧 苑丽 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第5期50-54,共5页
基因敲除（gene knockout）是从基因水平上研究基因功能最有效的方法之一。近来年,随着基因编辑技术的发展,基因敲除技术日趋成熟。文章从基因敲除的发展、技术原理以及在不同种生物中的应用等方面进行了阐述,概述了近几年基因敲除的方... 基因敲除（gene knockout）是从基因水平上研究基因功能最有效的方法之一。近来年,随着基因编辑技术的发展,基因敲除技术日趋成熟。文章从基因敲除的发展、技术原理以及在不同种生物中的应用等方面进行了阐述,概述了近几年基因敲除的方法及应用,以期为临床合理有效使用基因敲除技术提供参考。 展开更多
关键词 基因敲除 red同源重组 CRISPR/Cas9 Cre-loxp重组系统 RNA干扰
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用Red系统敲除大肠杆菌O157∶H7的ecs4553以及ecs4563基因 被引量：5
11
作者 刘徐兵 周围 +7 位作者 李玉霞 张京生 凌焱 胡伟 张书祥 张部昌 段海清 梁龙 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2007年第2期101-106,共6页
目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157∶H7的突变体。方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5′端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那... 目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157∶H7的突变体。方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5′端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除。结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7突变菌株。结论:为进一步研究EHEC O157∶H7的致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌O157:H7 ecs4553基因 ecs4563基因 red同源重组
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大肠杆菌ptsG基因缺陷菌株的构建及其发酵混合糖产L-丙氨酸 被引量：6
12
作者 潘海亮 王灿 +2 位作者 赵筱 王永泽 王金华 《中国酿造》 CAS 北大核心 2019年第11期160-164,共5页
为了增强大肠杆菌(Escherichia coli)JH-B2利用混合糖产L-丙氨酸的能力,通过Red同源重组技术敲除了转运葡萄糖的关键基因ptsG,构建新菌株JH-B3。结果表明,以10%混合糖(5%葡萄糖和5%木糖)为碳源,ptsG基因缺陷菌株JH-B3同时利用葡萄糖和木... 为了增强大肠杆菌(Escherichia coli)JH-B2利用混合糖产L-丙氨酸的能力,通过Red同源重组技术敲除了转运葡萄糖的关键基因ptsG,构建新菌株JH-B3。结果表明,以10%混合糖(5%葡萄糖和5%木糖)为碳源,ptsG基因缺陷菌株JH-B3同时利用葡萄糖和木糖,且在32 h时利用完葡萄糖,表明了ptsG基因的敲除大幅减弱了葡萄糖效应;而菌株JH-B2在发酵24 h时利用完葡萄糖,在28 h时才开始利用木糖,表现出葡萄糖效应。发酵至98 h,ptsG基因缺陷菌株JH-B3已经利用完木糖,其丙氨酸产量为94.1 g/L,生产强度为0.96 g/(L·h),而菌株JH-B2在同等时间内还剩18.10 g/L木糖未利用,其丙氨酸产量为77.6 g/L,生产强度为0.79 g/(L·h)。ptsG基因缺陷菌株JH-B3的丙氨酸生产强度较JH-B2提高了21.5%,能够同时利用混合糖发酵产丙氨酸,为利用木质纤维素糖源生产丙氨酸提供了工业应用基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌 red同源重组 混合糖 L-丙氨酸 葡萄糖效应
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大肠杆菌rhtA缺失对血红素合成的影响 被引量：6
13
作者 杨燕 郑珂 +1 位作者 潘梅 唐蕾 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期3216-3224,共9页
【背景】Escherichia coli BL21(DE3)是基因工程的常用宿主,以C5途径合成5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinicacid,ALA),ALA是合成血红素的重要前体物质,但ALA分泌对血红素合成的影响尚不清楚。【目的】阐明参与ALA外运的RhtA在血红素合成... 【背景】Escherichia coli BL21(DE3)是基因工程的常用宿主,以C5途径合成5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinicacid,ALA),ALA是合成血红素的重要前体物质,但ALA分泌对血红素合成的影响尚不清楚。【目的】阐明参与ALA外运的RhtA在血红素合成途径中的作用。【方法】利用Red同源重组,敲除Escherichia coli BL21(DE3)的rhtA,同时构建重组质粒pEA过表达血红素合成途径中的关键酶基因hemA,检测分析血红素及其前体物质含量,以及血红素合成途径中10个关键基因的表达水平。【结果】敲除rhtA对菌体生长没有显著影响,敲除菌株BL21(DE3)Δrht A与原始菌株BL21(DE3)比较,ALA的胞外含量下降23%,血红素含量提高12%,尿卟啉III (Uroporphyrin III,UIII)、粪卟啉III (Coproporphyrin III,CIII)和原卟啉IX (Protoporphyrin IX,PPIX)的含量分别提高25%、15%和18%;敲除rhtA同时过表达hemA的菌株BL21(DE3)ΔrhtA/pEA与仅过表达hemA的菌株BL21(DE3)/pEA比较,胞外ALA减少了16%,血红素含量提高了24%,UIII和CIII含量分别提高55%和64%,PPIX含量显著增加,约为4.7倍。实时定量PCR结果表明,rhtA缺失后,hemC基因转录水平下调,其余9个基因转录水平均有不同程度的上调。【结论】rhtA敲除减少了ALA的外运,使得胞内血红素产量得到提高。 展开更多
关键词 大肠杆菌 rhtA 5-氨基乙酰丙酸 血红素 red同源重组
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Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用 被引量：5
14
作者 孙旭 周长林 方宏清 《生物技术通讯》 CAS 2011年第6期873-878,共6页
Red同源重组技术发展迅速,已广泛应用于大肠杆菌基因组修饰,在点突变、基因敲除、序列整合等方面发挥着重要作用。简要综述了Red同源重组的重组机制和操作策略等研究进展,并介绍了Red同源重组在大肠杆菌基因组减小及多基因代谢途径优化... Red同源重组技术发展迅速,已广泛应用于大肠杆菌基因组修饰,在点突变、基因敲除、序列整合等方面发挥着重要作用。简要综述了Red同源重组的重组机制和操作策略等研究进展,并介绍了Red同源重组在大肠杆菌基因组减小及多基因代谢途径优化方面的应用情况。 展开更多
关键词 red同源重组 大肠杆菌 基因敲除 重组机制
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大肠杆菌ptsHIcrr操纵子的快速敲除及敲除菌生长性能测定 被引量：5
15
作者 周军智 邹永康 +3 位作者 戴红梅 李树龙 蔡亚非 方宏清 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1146-1152,共7页
敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(简称PTS系统)ptsHIcrr操纵子,考察敲除菌株生长特性并将其与ptsG敲除菌进行比较。利用I-SceⅠ特异性切割和Red同源重组方法成功构建了大肠杆菌DH5α△ptsHIcrr敲除菌。在LB培养基中,DH5... 敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(简称PTS系统)ptsHIcrr操纵子,考察敲除菌株生长特性并将其与ptsG敲除菌进行比较。利用I-SceⅠ特异性切割和Red同源重组方法成功构建了大肠杆菌DH5α△ptsHIcrr敲除菌。在LB培养基中,DH5α△ptsHIcrr的生长行为与DH5α和DH5α△ptsG明显不同,其最高菌密度是DH5α和DH5α△ptsG的近2倍,而DH5α△ptsG生长行为与DH5α无明显差异。但在含1%葡萄糖的LB中,DH5α△ptsHIcrr和DH5α△ptsG均表现出生长优势,最高菌密度依次是DH5α的2.8和2倍;培养液中最终乙酸含量分别是DH5α的12.2%、47%。在M9修饰培养基中,DH5α△ptsHIcrr比生长速率(1/h)和比葡萄糖消耗速率[g/(g.h)]明显低于DH5α,并略低于DH5α△ptsG。结果说明,ptsHIcrr操纵子敲除菌改变了葡萄糖的代谢速率,并呈现与ptsG基因敲除菌不同的代谢特点。 展开更多
关键词 red同源重组 PTS系统 ptsHIcrr操纵子 大肠杆菌
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肠炎沙门菌延伸因子EF-Tu缺失株对环境压力的应答变化 被引量：5
16
作者 刘松艳 周薇 +4 位作者 司微 王曼宇 张童利 刘思国 于申业 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期31-34,共4页
延伸热不稳定因子(EF-Tu)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是在蛋白质合成过程中负责肽链的延伸。为研究肠炎沙门菌EF-Tu的tuf A基因缺失对环境压力的应答变化,本研究利用改进的Red同源重组方法构建肠炎沙门氏菌SM6株的tuf A缺失株,... 延伸热不稳定因子(EF-Tu)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是在蛋白质合成过程中负责肽链的延伸。为研究肠炎沙门菌EF-Tu的tuf A基因缺失对环境压力的应答变化,本研究利用改进的Red同源重组方法构建肠炎沙门氏菌SM6株的tuf A缺失株,命名为SM6Δtuf A,并鉴定缺失株的形态学变化,分析耐酸性、渗透应力、温度缺氧应力、氧化应力的改变。结果表明缺失株对酸性条件及升温缺氧的耐受与亲本株相似;对渗透压的耐受稍强于亲本株,但差异不显著;对氧化压力的耐受显著弱于亲本株。本研究构建的肠炎沙门氏菌tuf A基因缺失株SM6Δtuf A,为进一步研究EF-Tu在沙门氏菌的生物学和致病机制中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 延伸因子EF-Tu red同源重组 沙门氏菌 生物学特性 环境压力
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大肠杆菌PTS系统改造及重组菌生长性能测定 被引量：5
17
作者 肖梦榕 张梁 +1 位作者 刘双平 石贵阳 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1561-1572,共12页
利用Red重组系统对野生大肠杆菌Escherichia coli磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system,PTS)进行修饰改造,敲除PTS系统中关键组分EⅡCBGlc的编码基因(ptsG),磷酸组氨酸搬运蛋... 利用Red重组系统对野生大肠杆菌Escherichia coli磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system,PTS)进行修饰改造,敲除PTS系统中关键组分EⅡCBGlc的编码基因(ptsG),磷酸组氨酸搬运蛋白HPr的编码基因(ptsI),同时敲入来源于运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis的葡萄糖易化体(Glucose facilitator)编码基因(glf),构建重组大肠杆菌,比较测定并系统评价了基因敲除和敲入对细胞的生长、葡萄糖代谢和乙酸积累的影响。敲除基因ptsG和ptsI造成大肠杆菌PTS系统部分功能缺失,细胞生长受到一定限制,敲入glf基因后,重组大肠杆菌能够利用Glf-Glk(葡萄糖易化体-葡萄糖激酶)途径,消耗ATP将葡萄糖进行磷酸化并转运进入细胞。通过该途径转运葡萄糖能够提高葡萄糖利用效率,降低副产物乙酸生成,同时能够使更多的碳代谢流进入后续相关合成途径,预期能够提高相关产物产量。 展开更多
关键词 大肠杆菌 运动发酵单胞菌 PTS系统 glf red同源重组 代谢工程 发酵
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表达PEDV S1蛋白重组PRV的构建与鉴定
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作者 侯晓璇 穆永 +5 位作者 王彪 王同燕 颜世君 王孟月 谭菲菲 田克恭 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期1003-1009,共7页
为了有效预防PED的感染,本研究将PEDV流行毒株的S1基因克隆至pcDNA3.1(+)载体中构建真核表达质粒,经鉴定S1蛋白表达后,获得S1基因表达盒,再将S1基因表达盒克隆至含有gG基因上下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒PUC-ABK中,构建供体质... 为了有效预防PED的感染,本研究将PEDV流行毒株的S1基因克隆至pcDNA3.1(+)载体中构建真核表达质粒,经鉴定S1蛋白表达后,获得S1基因表达盒,再将S1基因表达盒克隆至含有gG基因上下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒PUC-ABK中,构建供体质粒PUC-ABK-CMV-S1,获得线性同源重组片段A-CMV-S1-K-B。利用Red同源重组技术将线性同源重组片段电转化至含有pPRVBac-GFP-TK--gE--gI--US9--2-的感受态中获得重组pPRVBac-S1,最后拯救获得重组病毒rPRV-S1。PCR及IFA鉴定结果显示S1基因成功转录且表达,为研制PEDV活载体疫苗提供了实验依据。 展开更多
关键词 PEDV S1蛋白 red同源重组 重组PRV
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大肠杆菌qseC基因敲除及其缺陷株生物被膜形成的研究 被引量：4
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作者 杨堃 雷玉洁 +2 位作者 黄云超 叶联华 赵光强 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期776-780,共5页
目的通过Red同源重组法构建qseC基因缺失的大肠杆菌突变株，并探讨qseC基因对大肠杆菌生物被膜形成的影响。方法PCR扩增两翼与目的基因上下游同源、含有氯霉素抗性基因片段，电击转化入大肠杆菌MCl000，在Red同源重组酶作用下，用含同... 目的通过Red同源重组法构建qseC基因缺失的大肠杆菌突变株，并探讨qseC基因对大肠杆菌生物被膜形成的影响。方法PCR扩增两翼与目的基因上下游同源、含有氯霉素抗性基因片段，电击转化入大肠杆菌MCl000，在Red同源重组酶作用下，用含同源臂的氯霉素抗性片段置换目的基因qseC，并利用FLP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除。结晶紫染色半定量法分析qseC基因缺失株生物被膜形成能力的变化。结果PCR及DNA测序结果表明，qseC基因已被成功敲除。在LB培养基中，qseC基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异。MCl000与MCl000△qseC基因缺失株生物被膜形成能力半定量A值的结果分别为1．00±0．15和0．47±0．10。结论成功构建大肠杆菌qseC基因缺失突变株，且qseC基因对细菌生物被膜的形成具有调控作用。 展开更多
关键词 大肠杆菌 qseC基因 red同源重组 密度感应 细菌生物被膜
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鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对Ⅲ型分泌系统相关基因的调控
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作者 张家莉 潘永 +3 位作者 段世宇 令狐远凤 郑如雯 杨琦 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2023年第4期512-518,共7页
细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控,利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株,在此基础上利用P22噬菌体转... 细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控,利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株,在此基础上利用P22噬菌体转导技术分别构建上述融合菌株与gcvB、hfq的单缺失菌株,通过qPCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测gcvB、hfq缺失后各基因的转录水平和蛋白水平的变化。结果显示:与标准菌株相比,gcvB缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调;prgJ、prgK的转录水平上调,蛋白水平下调。hfq缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调,prgH、prgI、prgJ、prgK的蛋白水平下调。表明Hfq和GcvB均可对spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK进行调控。上述结果可为鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和Hfq的作用机理研究提供参考。 展开更多
关键词 鼠伤寒沙门菌 red同源重组 GcvB HFQ Ⅲ型分泌系统
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