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红色荧光蛋白DsRed2基因在大肠杆菌中的表达和观察及其在本科实验教学中的应用 被引量:10
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作者 邢万金 赵宇航 +1 位作者 任仕超 包晓红 《内蒙古大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期548-551,601,共5页
用PCR方法从质粒pDsRed2-1中扩增获得DsRed2,亚克隆到pMD19-T载体上,然后酶切将DsRed2分别插入到原核表达载体pET-Trx和pGEX-4T1上,转入E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达.在LB平板培养基上或液体培养基中直接观察菌体颜色,最后用SDS-P... 用PCR方法从质粒pDsRed2-1中扩增获得DsRed2,亚克隆到pMD19-T载体上,然后酶切将DsRed2分别插入到原核表达载体pET-Trx和pGEX-4T1上,转入E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达.在LB平板培养基上或液体培养基中直接观察菌体颜色,最后用SDS-PAGE检测DsRed2蛋白的表达.结果显示构建的重组载体pET-Trx-DsRed2和pGEX-GST-DsRed2在E.coli中成功表达,且不形成多聚体.LB平板培养基上和IPTG诱导24h后的液体培养基中都能直接观察到红色荧光,说明DsRed2可以作为原核表达系统的报告基因. 展开更多
关键词 原核表达 红色荧光蛋白 Dsred2 实验教学
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覆土层益生菌恶臭假单胞菌TK3对双孢蘑菇的促生作用 被引量:8
2
作者 王琳 魏启舜 +4 位作者 周影 赵荷娟 陈悦 李辉信 郭成宝 《食用菌学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期23-29,107,共8页
为研究恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TK3对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的促生作用,用红色荧光蛋白rfp基因标记菌株TK3,获得的转化子TK3(rfp)在紫外光照射下发出红色荧光,且转入的rfp基因未对TK3细胞产生毒性。将TK3(rfp)与双孢蘑... 为研究恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TK3对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的促生作用,用红色荧光蛋白rfp基因标记菌株TK3,获得的转化子TK3(rfp)在紫外光照射下发出红色荧光,且转入的rfp基因未对TK3细胞产生毒性。将TK3(rfp)与双孢蘑菇菌丝进行共培养,发现TK3(rfp)可促进双孢蘑菇菌丝的生长并促进菌丝扭结成团。在覆土层中喷施TK3(rfp)菌液,20d后覆土层中细菌总数和TK3(rfp)数量随着TK3(rfp)喷施量的增加而增加,说明TK3(rfp)能在覆土层中定殖,当喷施浓度为每克覆土107cfu时,与对照相比,双孢蘑菇子实体产量增加24.9%。 展开更多
关键词 恶臭假单胞菌 红色荧光蛋白 双孢蘑菇 覆土 促生
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利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代
3
作者 章力 魏凯 +9 位作者 李珊珊 宁宇 路菲菲 王孝宣 国艳梅 刘磊 李鑫 杜永臣 李君明 黄泽军 《山东农业科学》 北大核心 2024年第4期1-8,共8页
转基因技术有助于番茄基因功能研究和遗传改良,其中转基因后代的筛选是一个非常重要但工作量大的环节。本研究基于番茄油体蛋白基因家族序列分析和番茄基因表达数据库SGN-TEA搜索结果,克隆了一个种子特异且高水平表达的油体蛋白基因SlOL... 转基因技术有助于番茄基因功能研究和遗传改良,其中转基因后代的筛选是一个非常重要但工作量大的环节。本研究基于番茄油体蛋白基因家族序列分析和番茄基因表达数据库SGN-TEA搜索结果,克隆了一个种子特异且高水平表达的油体蛋白基因SlOLE1(Solyc06g034040)。利用无缝克隆的方法将红色荧光蛋白基因TagRFP的编码区序列插入到SlOLE1基因的终止密码子前,形成一个嵌合基因SlOLE1-TagRFP。将嵌合基因插入到pBI121双元载体,构建植物表达载体pSlOLE1-TagRFP,利用农杆菌介导法转化番茄品种‘Money Maker’,T_(0)代植株的自交种子在荧光显微镜下呈现出明亮红色荧光或无荧光。PCR分子标记进一步验证发现,红色荧光种子萌发的幼苗均存在TagRFP序列,表明在种子阶段检测红色荧光筛选转基因番茄后代的准确率为100%。由此,本研究建立了一种利用SlOLE1-TagRFP嵌合基因,可以通过种子红色荧光可视化分析,简单快速、低成本地鉴定转基因番茄后代的方法。 展开更多
关键词 番茄 种子 红色荧光蛋白 油体蛋白 转基因鉴定
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大鼠胚胎原代海马神经元两种转染方法的比较 被引量:6
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作者 郑红云 李艳 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期689-692,共4页
目的:原代海马神经元是原代细胞中比较难转染的细胞,为了得到比较高的转染效率,通过比较Li-pofectamine2000转染法和大鼠神经元核电转法(rat neuron nucleofector kit)转染效率及转染前后细胞的存活率,来探讨Nucleofector Kit核电转法... 目的:原代海马神经元是原代细胞中比较难转染的细胞,为了得到比较高的转染效率,通过比较Li-pofectamine2000转染法和大鼠神经元核电转法(rat neuron nucleofector kit)转染效率及转染前后细胞的存活率,来探讨Nucleofector Kit核电转法的高效性。方法:选取胚胎18 d(E18)大鼠的海马神经元进行原代培养,获取海马神经元单细胞悬液后,于种植前和种植24 h后分别采用Nucleofector Kit和Lipofectamine 2000转染红色荧光蛋白(red fluorescence protein,DsRed)质粒。神经元转染48 h后分别采用轴突标记物Tau-1进行免疫荧光染色鉴定神经元。神经元的存活率采用台盼兰进行检测。结果:Lipofectamine2000的基因转染率仅为5.34%,而大鼠神经元Nucleofector Kit的转染率为44.54%,后者为前者的8.34倍。Lipofectamine2000转染细胞前后的存活率分别为98.56%和91.44%,而Nucleofector Kit组分别为98.26%和74.02%。结论:大鼠神经元核电转法能高效稳定的转染原代海马神经元。 展开更多
关键词 海马神经元 转染 Lipofectamine2000 Nucleofector KIT 红色荧光蛋白 大鼠
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双模态标记F344大鼠骨髓间充质干细胞移植入大鼠心脏后离体及在体影像示踪 被引量:4
5
作者 曹剑 王怡宁 +6 位作者 石新琳 马国涛 孔令燕 薛华丹 雷晶 何泳蓝 金征宇 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期474-479,共6页
目的利用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)标记带有红色荧光蛋白(RFP)的F344大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),探索双模态成像示踪标记干细胞示踪的可行性。方法使用含USPIO(40μg Fe/ml)的培养基与BMSCs/RFP共孵育培养24 h,标记后行普鲁士蓝染色... 目的利用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)标记带有红色荧光蛋白(RFP)的F344大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),探索双模态成像示踪标记干细胞示踪的可行性。方法使用含USPIO(40μg Fe/ml)的培养基与BMSCs/RFP共孵育培养24 h,标记后行普鲁士蓝染色、透射电镜检查及台盼蓝染色验证标记的有效性和安全性。实验组(n=8)通过心肌局部注射方式将双标干细胞移植至急性心肌梗死F344大鼠的梗死心肌周围,术后不同时间点(1 d、1周、2周和4周)行磁共振成像和荧光成像,对双标干细胞进行示踪并比较信号强度变化;对照组(n=2)不注射细胞,行磁共振和光学成像。4周后将大鼠麻醉处死后取心脏病理行HE染色、普鲁士蓝染色和荧光成像,观察双标干细胞在心肌内的分布。结果共孵育培养24 h的方式可以有效、安全地构建USPIO-RFP双标BMSCs干细胞,普鲁士蓝染色显示USPIO标记阳性率为99%,透射电镜提示USPIO颗粒主要位于胞质内溶酶体中。台盼蓝染色显示标记组和阴性对照组活细胞率差异无统计学意义(95.7%比96.3%,P>0.05)。心肌局部注射双标干细胞的实验组8只大鼠,磁共振成像在术后4周内均能观察到注射区域信号强度降低,并且信号强度随时间的延长变化无统计学意义(P=0.66);在体荧光成像未能检测到荧光信号,而离体荧光成像检测到心脏表面细胞注射区域有较弱的荧光。病理切片染色显示梗死心肌周围细胞核密度增加,心肌中蓝染颗粒及荧光成像发光分布区域与HE染色中细胞核密度增加区域一致。结论USPIO-RFP双标干细胞注射至大鼠急性梗死心肌后,在体磁共振成像在一定时间内能够实现对干细胞的示踪成像,离体荧光成像和病理荧光成像可以示踪移植干细胞。 展开更多
关键词 红色荧光蛋白 超小超顺磁性氧化铁 骨髓间充质干细胞 荧光成像 磁共振成像
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蛋白质的曙红Y-中性红逆向能量转移荧光法测定 被引量:3
6
作者 刘保生 薛春丽 +1 位作者 王晶 吕云开 《分析测试学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期345-348,共4页
在pH2.35的B-R缓冲溶液中,酸性染料曙红Y(EY)与碱性染料中性红(NR)之间由于静电吸引能够发生有效的能量转移,使能量受体NR荧光增强,能量给体EY的荧光猝灭。在该体系中加入人血清白蛋白(HSA),由于竞争作用使得HSA的加入破坏了EY-NR间的... 在pH2.35的B-R缓冲溶液中,酸性染料曙红Y(EY)与碱性染料中性红(NR)之间由于静电吸引能够发生有效的能量转移,使能量受体NR荧光增强,能量给体EY的荧光猝灭。在该体系中加入人血清白蛋白(HSA),由于竞争作用使得HSA的加入破坏了EY-NR间的能量转移,产生了明显的逆向反应,并且生成HSA-EY络合物,利用该络合物的荧光增加强度与HSA含量间的线性关系建立了一种测定微量血清蛋白的新方法。结果表明,血清蛋白工作曲线线性范围为0.6~12.0mg/L;方法检出限为0.25mg/L;6次平行测定相对标准偏差为1.94%~4.58%;回收率为96%~105%。该方法的稳定性好、选择性高,直接用于人血清试样中总蛋白含量的测定,实验结果与常用的双缩脲法基本一致。 展开更多
关键词 曙红Y 中性红 荧光能量转移 蛋白
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红肉苹果MdMKK9互作蛋白的筛选与鉴定
7
作者 孙晓红 李欣欣 +2 位作者 王彦博 陈奕州 张玉刚 《山东农业科学》 北大核心 2023年第2期20-29,共10页
MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一,是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶。为深入研究苹果MKK9的相关功能,以红肉苹果‘黛红’为材料,克隆到MdMKK9基因CDS序列,利用酵母双杂交试验筛选苹果cDNA文库,并通... MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一,是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶。为深入研究苹果MKK9的相关功能,以红肉苹果‘黛红’为材料,克隆到MdMKK9基因CDS序列,利用酵母双杂交试验筛选苹果cDNA文库,并通过酵母双杂交筛选、体内双分子荧光互补(BiFC)和体外Pull-down试验进行MdMKK9互作蛋白验证。结果表明,通过对苹果cDNA文库的筛选,共获得11个参与调控植物生长发育及应答逆境胁迫的候选互作蛋白;选取花青苷合成相关蛋白MdCHS及氮胁迫调控相关蛋白MdSPX3进行酵母双杂交、体内BiFC及体外Pull-down试验,结果证明MdMKK9可与MdSPX3互作。 展开更多
关键词 红肉苹果 MdMKK9 酵母双杂交 双分子荧光互补 互作蛋白
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细胞角蛋白19启动子调控的双报告载体的构建及其在肝干/祖细胞分化研究中的应用 被引量:3
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作者 张衡 贾雅丽 +6 位作者 岳文 陈琳 谢小燕 南雪 何丽娟 裴海云 裴雪涛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2010年第7期728-736,共9页
肝干/祖细胞是肝细胞和胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)共同的前体细胞,为了对这一前体细胞的分化情况进行研究,利用报告基因来监测肝干/祖细胞的分化走向.首先,通过PCR方法从肝癌细胞系HepG2的全基因组中克隆了细胞角蛋白... 肝干/祖细胞是肝细胞和胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)共同的前体细胞,为了对这一前体细胞的分化情况进行研究,利用报告基因来监测肝干/祖细胞的分化走向.首先,通过PCR方法从肝癌细胞系HepG2的全基因组中克隆了细胞角蛋白19(CK19)启动子片段,构建了CK19启动子调控的海肾荧光素酶和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)双报告载体(pSicoR-CK19-hrl-mrfp).其次,将上述慢病毒载体转染肝干/祖细胞后,通过流式细胞分选获得稳定转染的细胞株.再次,将上述细胞株与表达"上皮形态发生素"(Epimorphin,EPM)的PT67细胞共培养后,整合有pSicoR-CK19-hrl-mrfp表达载体的肝干/祖细胞不仅形态发生了变化,而且排列为二维环状结构,另外还检测到由CK19启动子启动表达的海肾荧光素酶和RFP,细胞形态和基因表型都证明肝干/祖细胞经诱导已经分化成为BECs.与此形成对照的是肝干/祖细胞与不表达EPM的PT67细胞共培养后,没有观测到上述的变化.所以,CK19启动子调控的双报告载体不仅可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向,而且还可以定量地检测CK19启动子活性的变化情况.总之,这一载体的成功构建将为研究肝干/祖细胞的分化提供了便捷的工具,同时也有助于筛选可诱导肝干/祖细胞定向分化的分子. 展开更多
关键词 细胞角蛋白 海肾荧光素酶 红色荧光蛋白 肝干/祖细胞 分化
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板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建 被引量:2
9
作者 杨峰 施李鸣 +4 位作者 范素华 谭俊 谢涛 商巾杰 陈保善 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期308-315,共8页
低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿... 低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155。将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象。板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料。 展开更多
关键词 板栗疫病菌 绿色荧光蛋白 红色荧光蛋白 共定位 载体构建
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小鼠膀胱癌红色荧光移植瘤模型建立及荧光影像学特点分析 被引量:2
10
作者 杨彬 杨晓峰 +3 位作者 付奎 汪海龙 王炜 王晔 《中华泌尿外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期331-334,共4页
目的 研究红色荧光蛋白(DsRed)标记小鼠膀胱癌生长转移的分子荧光影像学特征.方法 采用脂质体2000介导基因转染法将chickenβ-actin-DsRed-Neo载体转染到小鼠膀胱癌BTT739细胞株;G418筛选后获得稳定表达DsRed的单克隆细胞(BTT739-Ds... 目的 研究红色荧光蛋白(DsRed)标记小鼠膀胱癌生长转移的分子荧光影像学特征.方法 采用脂质体2000介导基因转染法将chickenβ-actin-DsRed-Neo载体转染到小鼠膀胱癌BTT739细胞株;G418筛选后获得稳定表达DsRed的单克隆细胞(BTT739-DsRed);615小鼠24只随机分3组,后肢皮下注射细胞悬液,第1、2组注射BTT739-DsRed细胞,第3组注射BTT739细胞,建立移植瘤模型.MAESTRO活体成像仪设定激发光波长560~580 nm,发射光波长590~610 nm,曝光时间5000 ms,连续观察4周,第2组每周处死小鼠并剖开成像,记录肿瘤生长转移的荧光影像,测定肿瘤大小及荧光信号值.统计分析肿瘤大小与荧光信号值,全身成像与剖开成像之间的关系.结果 第1周观测到发红色荧光的肿瘤,第2周观测到肿瘤中央局部荧光缺失,病理证实为肿瘤坏死组织及少量结缔组织,第4周观测到局部淋巴结转移,未见远处转移.第1组连续4周肿瘤荧光信号值依次为(89±18)、(122±55)、(133±69)、(715±343)counts;肿瘤大小依次为(13±4)、(45±22)、(83±29)、(253±67)mm2;第2组全身成像4周肿瘤大小依次为(12±3)、(50±23)、(90±29)、(290±74)mm2,剖开成像依次为(12±5)、(72±30)、(141±43)、(524±237)mm2;肿瘤大小与荧光信号强度呈线性正相关(r=0.74,t=3.97,P〈0.05),全身成像与剖开成像肿瘤大小呈线性正相关(r=0.97,t=10.00,P〈0.05),全身成像测得的肿瘤大小为剖开后成像的(70.85±17.13)%. 结论小鼠膀胱癌红色荧光移植瘤模型可以直观、连续、敏感地观察肿瘤的生长和转移,随着肿瘤增大,荧光范围也增大,肿瘤发生坏死后荧光消失,肿瘤发生转移后红色荧光表达亦随之转移. 展开更多
关键词 红色荧光蛋白 膀胱肿瘤 全身成像 动物模型
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SVZ神经干细胞分化过程中的Bmp4启动子活性分析 被引量:1
11
作者 刘仕勇 杨辉 +2 位作者 张治元 宋业纯 邱克军 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第20期1784-1787,共4页
目的 室管膜下层 (Subventricularzone ,SVZ)神经干细胞分化过程中的Bmp4启动子活性分析及其与神经元分化的关系。方法 在构建Bmp4启动子———红色荧光蛋白报告载体基础上转染SVZ神经干细胞 ,动态地观察报告基因在SVZ神经干细胞分化... 目的 室管膜下层 (Subventricularzone ,SVZ)神经干细胞分化过程中的Bmp4启动子活性分析及其与神经元分化的关系。方法 在构建Bmp4启动子———红色荧光蛋白报告载体基础上转染SVZ神经干细胞 ,动态地观察报告基因在SVZ神经干细胞分化过程中的表达 ,并进行显微计数和神经元标志物流式细胞仪检测。结果 SVZ神经干细胞贴壁分化过程中具有较高的Bmp4启动子活性 ,48h阳性率达到 8.6%,且明显高于皮层神经干细胞。SVZ神经干细胞的Bmp4启动子活性与神经元分化高度正相关 (r =0 .80 5 ,P <0 .0 5 ) ,皮层神经元分化与Bmp4启动子活性相关不明显。结论 采用启动子活体荧光标记 ,能够较好地反映正常情况下内在蛋白的表达情况 ;Bmp4启动子活性与SVZ神经干细胞向神经元的分化高度相关 。 展开更多
关键词 室管膜下层 神经干细胞 骨形成蛋白 红色荧光蛋白
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白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体的构建及其在肝干细胞分化研究中的应用 被引量:1
12
作者 李文林 苏娟 +2 位作者 陶欣荣 Joseph T Lau 胡以平 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期237-239,共3页
目的:利用报告基因监测肝干细胞的分化走向。方法:通过PCR从小鼠基因组中克隆了细胞角蛋白19 启动子片段,构建了细胞角蛋白19启动子调控的绿色荧光蛋白(pCK19 EGFP)和白蛋白启动子调控的红色荧光蛋白报告载体(pAlbD sRed),并利用报告载... 目的:利用报告基因监测肝干细胞的分化走向。方法:通过PCR从小鼠基因组中克隆了细胞角蛋白19 启动子片段,构建了细胞角蛋白19启动子调控的绿色荧光蛋白(pCK19 EGFP)和白蛋白启动子调控的红色荧光蛋白报告载体(pAlbD sRed),并利用报告载体标记的肝干细胞(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)观察了悬浮培养时LEPCs的分化去向。结果:白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向。结论:双色荧光蛋白报告载体的成功构建为研究LEPCs的分化、筛选可诱导LEPCs定向分化的分子提供了便捷的工具。 展开更多
关键词 肝干细胞 细胞分化 白蛋白 细胞角蛋白19 启动子 红色荧光蛋白 绿色荧光蛋白 基因.报告
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一种可用活体荧光成像技术检测的前列腺原位肿瘤模型的建立 被引量:1
13
作者 刘旭东 曾津 +6 位作者 杨林 徐珊 张涛 谢宏俊 马振坤 王新阳 贺大林 《现代泌尿外科杂志》 CAS 2012年第3期225-228,共4页
目的建立可用活体荧光成像技术动态观察前列腺原位肿瘤发生及生长的裸鼠模型。方法 10只BALB/c裸鼠前列腺背侧包膜内注入携带红色荧光蛋白(RFP)的前列腺癌PC-3细胞(PR7细胞)悬液20μL,第2、4、6、8周分别用非侵入式活体分子影像系统观... 目的建立可用活体荧光成像技术动态观察前列腺原位肿瘤发生及生长的裸鼠模型。方法 10只BALB/c裸鼠前列腺背侧包膜内注入携带红色荧光蛋白(RFP)的前列腺癌PC-3细胞(PR7细胞)悬液20μL,第2、4、6、8周分别用非侵入式活体分子影像系统观察前列腺原位肿瘤发生及其转移情况。尸检取前列腺原位肿瘤、肺、肝、肾、股骨、盆腔淋巴结等组织,制成冰冻切片,通过荧光显微镜下观察及HE染色等方法分别检测肿瘤发生及有无转移等情况。结果第2周开始可用非侵入式活体分子影像系统检测到前列腺原位肿瘤形成,第4周开始可于裸鼠下腹部触及原位肿瘤,第6~8周裸鼠逐渐出现恶液质。荧光信号随原位肿瘤长大而增强,但并未见明显转移灶。尸检也未发现转移灶。结论前列腺包膜内注入携带RFP的前列腺癌PR7细胞可成功建立可用活体荧光成像技术监测的前列腺原位肿瘤模型,该模型可作为研究前列腺肿瘤发生发展及治疗方式的较理想的动物模型。 展开更多
关键词 红色荧光蛋白 活体荧光成像 前列腺肿瘤 原位肿瘤 裸鼠
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表达红色荧光蛋白DsRed报告基因的逆转录病毒载体的构建和在肝干细胞体内示踪中的应用 被引量:1
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作者 李文林 苏娟 +2 位作者 陶欣荣 Joseph T Lau 胡以平 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期240-242,共3页
目的:建立表达红色荧光蛋白DsRed的逆转录病毒载体,并对肝原始细胞进行体外标记和体内示踪研究。方法:将pDsRed1 1载体中的DsRed片段克隆到逆转录病毒载体pLNCG C1中构建了pLNCG DsRed载体。将该载体导入Phoenix包装细胞,进而采用乒乓... 目的:建立表达红色荧光蛋白DsRed的逆转录病毒载体,并对肝原始细胞进行体外标记和体内示踪研究。方法:将pDsRed1 1载体中的DsRed片段克隆到逆转录病毒载体pLNCG C1中构建了pLNCG DsRed载体。将该载体导入Phoenix包装细胞,进而采用乒乓转染的方法感染包装细胞PT67,获得高滴度稳定产毒的PT67 细胞系。结果:利用PT67 细胞系产生的病毒上清可以高效的感染体外培养的肝原始细胞系。将这些DsRed标记的肝原始细胞移植到小鼠损伤肝脏中,4周后可以在再生肝脏中清晰地观察到具有红色荧光的外源细胞。结论:由于肝脏组织没有红色自发荧光,用DsRed标记肝原始细胞进行肝内示踪时背景干扰小。 展开更多
关键词 红色荧光蛋白 基因.报告 逆转录病毒载体 肝干细胞
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Regulation of BMP4 on the proliferation and differentiation in SVZa neural stem cells
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作者 LIUShiyong ZHANGZhiyuan +6 位作者 SONGYechun QIUKejun ZHANGKecheng ANNing ZHOUZheng CAIWenqin YANGHui 《Chinese Science Bulletin》 SCIE EI CAS 2004年第11期1126-1136,共11页
The neural stem cells in the anterior subventricula zone (SVZa) mainly generate the progenitors that will differentiate into neurons, and along a highly circumscribed migratory access-Rostral migratory stream (RMS), t... The neural stem cells in the anterior subventricula zone (SVZa) mainly generate the progenitors that will differentiate into neurons, and along a highly circumscribed migratory access-Rostral migratory stream (RMS), they migrate to the olfactory bulbs (OB). To understand the effects of BMPs on SVZa neural stem cells, in this study BMP4 at various concentrations was used to induce SVZa ,neural stem cells, aud the living cell labeling using BMP4 pronmtor conjugated with red fluorescence protein showed the expression of BMP4 dynamically. The results demonstrated that low BMP4 doses (1-5 ng/mL) promoted while high doses(10-100 ng/mL) inhibited the proliferation of SVZa neural stem cells, and BMP4 promoted neuron differentiation in the early stage (1-3 d), howeverm, it inhibited the neuron commitment after 4 d. Noggin, the antagonist of BMP4, blocked the physiological effects of BMP4. In OB, BMP4 is mainly to accelerate the progenitors to withdraw from the cell cycle and trigger the differentiation, and in RMS, it promotes the proliferation of committed progenitors and not differentiation, further in SVZa, BMP4 enhances astrocyte commitment. 展开更多
关键词 神经干细胞 分芽繁殖 骨形态发生蛋白 红荧光蛋白 绿荧光蛋白 前向次心室带
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两种转染人宫颈癌HeLa细胞的方法学比较
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作者 郑红云 李艳 申复进 《临床和实验医学杂志》 2014年第16期1321-1323,共3页
目的比较两种不同的转染方法,即Lipofectamine2000和Nucleofector Kit转染人宫颈癌Hela细胞的转染效率。方法分别选取Lipofectamine2000转染和Amax核电转( Amax Nucleofector Kit)两种转染方法。HeLa细胞培养贴壁达到85%~90%后传代获... 目的比较两种不同的转染方法,即Lipofectamine2000和Nucleofector Kit转染人宫颈癌Hela细胞的转染效率。方法分别选取Lipofectamine2000转染和Amax核电转( Amax Nucleofector Kit)两种转染方法。HeLa细胞培养贴壁达到85%~90%后传代获取HeLa单细胞悬液,细胞分成2管,其中1管直接采用核电转法转染红色荧光蛋白( DsRed)后种植于1.5 ml的细胞培养皿;另一管先种植于细胞培养皿,待贴壁24 h后采用Lipofectamine2000转染DsRed。细胞的存活率采用台盼兰进行检测。分别比较两者转染效率及转染前后细胞的存活率,进一步探讨Nucleofector Kit核电转法的高效性。结果 Lipofectamine2000的基因转染率仅为20.23%,而核电转法的转染率为90.14%,后者为前者的4.46倍。Lipo-fectamine2000转染细胞前后的存活率分别为96.34%和90.76%,而核电转组分别为95.98%和78.35%。结论细胞核电转法能高效稳定地转染人宫颈癌细胞株HeLa细胞。 展开更多
关键词 宫颈癌 HELA细胞 转染 Lipofectamine2000 核电转 红色荧光蛋白
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红色荧光蛋白标记的小鼠胚胎干细胞系建立及体内成瘤的初步研究
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作者 赵无恙 刘韬 钱其军 《浙江理工大学学报(自然科学版)》 2015年第2期244-248,共5页
建立能够稳定表达红色荧光的小鼠胚胎干细胞系,并研究其在体内不同部位形成畸胎瘤的能力。构建含红色荧光蛋白(DsRed-Express)的表达质粒,并采用磷酸钙法包装成慢病毒转染小鼠胚胎干细胞(mESCs)。筛选得到强阳性克隆,对其进行RT-PCR检... 建立能够稳定表达红色荧光的小鼠胚胎干细胞系,并研究其在体内不同部位形成畸胎瘤的能力。构建含红色荧光蛋白(DsRed-Express)的表达质粒,并采用磷酸钙法包装成慢病毒转染小鼠胚胎干细胞(mESCs)。筛选得到强阳性克隆,对其进行RT-PCR检测和裸鼠、C57小鼠体内成瘤实验验证细胞特性,最后获得稳定表达红色荧光的胚胎干细胞(Red-ESCs)。Red-ESCs能够表达多能性基因,如Oct4,Sox2,Nanog等,也能在裸鼠体内成瘤。不同部位的畸胎瘤在基因表达上有差异,其中肝部形成的畸胎瘤表达肝特性基因。成功建立稳定表达红色荧光的小鼠胚胎干细胞系,其在体内形成的畸胎瘤性质受到体内环境的影响。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 红色荧光蛋白 畸胎瘤 肝特异性基因
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一种红色荧光蛋白基因稳定转化的家蚕细胞株构建及应用
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作者 陈和 陈琴 +5 位作者 梅文枫 钱月忠 聂作明 于威 陈健 张耀洲 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期507-513,共7页
构建一种红色荧光蛋白基因稳定转化的家蚕细胞株,用于检测细胞是否被家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染和快速、便捷地测定BmNPV滴度。首先构建BmNPV多角体蛋白基因(polh)启动子驱动的红色荧光蛋白基因(DsRed)表达盒,然后将该表达盒克隆至p... 构建一种红色荧光蛋白基因稳定转化的家蚕细胞株,用于检测细胞是否被家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染和快速、便捷地测定BmNPV滴度。首先构建BmNPV多角体蛋白基因(polh)启动子驱动的红色荧光蛋白基因(DsRed)表达盒,然后将该表达盒克隆至pIZT/V5-His中构建稳定转化载体pIZT-DsRed并转染家蚕卵巢上皮细胞BmN,经过终浓度为300μg/mL的博莱霉素(zeocin)筛选3个月后,最终获得DsRed稳定转化的家蚕细胞株BmN-RFP。当该细胞株感染BmNPV后,由于病毒晚期表达因子的活化引发polh启动子控制的DsRed表达,在荧光显微镜下可以观察到感染病毒的细胞发出红色荧光,因而BmN-RFP可用来指示BmNPV的感染。利用BmN-RFP细胞株,采用终点稀释法仅用3 d时间即可完成BmNPV滴度的测定。 展开更多
关键词 红色荧光蛋白 家蚕卵巢上皮细胞 家蚕核型多角体病毒 病毒滴度 稳定转化
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远红荧光蛋白报告基因mKate2对肝癌细胞的标记及荧光成像 被引量:5
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作者 李丹 沈敏 +7 位作者 张波 李征然 庞鹏飞 朱康顺 王劲 黄明声 孟晓春 单鸿 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第19期1344-1347,共4页
目的 制备远红荧光蛋白报告基因mKate2慢病毒,用于标记人肝癌细胞株HepG2,并进行体外的细胞荧光成像,为肿瘤的活体荧光成像示踪提供基础.方法 以pmKate2-N质粒为模板,将mKate2基因克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST;pLenti6.3-mKa... 目的 制备远红荧光蛋白报告基因mKate2慢病毒,用于标记人肝癌细胞株HepG2,并进行体外的细胞荧光成像,为肿瘤的活体荧光成像示踪提供基础.方法 以pmKate2-N质粒为模板,将mKate2基因克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST;pLenti6.3-mKate2表达质粒和包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并测定慢病毒的活性滴度;mKate2慢病毒以病毒感染复数(MOI)=6感染HepG2 96 h后,通过荧光显微镜观察和流式细胞分析法(FACS)检测感染效率;收集2×106个mKate2-HepG2细胞,通过光学成像系统进行荧光成像,确定最佳成像参数.结果 测序结果显示,mKate2基因序列正确,无突变或缺失;mKate2慢病毒的活性滴度为1.6×106TU/ml;mKate2慢病毒感染HepG2 96 h后,荧光显微镜下观察到大量红色荧光蛋白的表达,FACS检测显示mKate2的阳性率为93.8%±0.4%;激发光(530±15)nm和发射光(710±28)am为对mKate2-HepG2细胞进行荧光成像的最佳参数.结论 慢病毒能够介导远红荧光蛋白报告基因mKate2对人肝癌细胞株HepG2的高效标记,并且mKate2标记的HepG2能够进行体外细胞荧光成像,可以用于下一步的活体肿瘤示踪研究. 展开更多
关键词 远红荧光蛋白 基因 报告 肝肿瘤
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不同剂量BMSC尾静脉输注对小鼠肺组织纤维化的影响 被引量:5
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作者 徐佳波 李燕芹 +3 位作者 李莉 刘斌 熊剑飞 叶青 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1157-1162,共6页
目的研究经尾静脉输注不同剂量的骨髓间充质干细胞(BMSC)对小鼠肺纤维化的影响。方法体外培养雄性转红色荧光蛋白(RFP)基因FVB小鼠BMSC。将24只FVB雌性受体小鼠随机分为正常组、模型组、BMSC治疗1组(BMSC 1组)和BMSC治疗2组(BMSC 2组)(n... 目的研究经尾静脉输注不同剂量的骨髓间充质干细胞(BMSC)对小鼠肺纤维化的影响。方法体外培养雄性转红色荧光蛋白(RFP)基因FVB小鼠BMSC。将24只FVB雌性受体小鼠随机分为正常组、模型组、BMSC治疗1组(BMSC 1组)和BMSC治疗2组(BMSC 2组)(n=6)。模型组、BMSC 1组和BMSC 2组小鼠分别经气管内注射博莱霉素制备肺纤维化模型。建模24 h后,BMSC 1组和BMSCs 2组小鼠分别经尾静脉注射BMSC 1×106/只和2×106/只。于建模后第21天处死所有小鼠,制备小鼠肺组织标本。光学显微镜观察病理学变化;激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法进行RFP(+)BMSC分布观察和RFP定量分析;免疫组织化学法检测肺表面活性物质蛋白A(SP-A)表达;碱水解法测定羟脯氨酸(Hyp)含量;Real-time PCR检测转化生长因子-β(TGF-β)和血小板衍生生长因子(PDGF)mRNA表达。结果小鼠肺组织纤维化程度,BMSC 1组较模型组显著减轻,而BMSC 2组较模型组明显加重。BMSC 2组在肺间质纤维化活跃区域可见大量RFP(+)BMSC且其形态类似成纤维细胞。SP-A表达,正常组>BMSC 1组>BMSC 2组和模型组(均P<0.05),而BMSC 2组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Hyp含量,正常组<BMSC 1组<模型组<BMSC 2组(P<0.01,P<0.05);TGF-β和PDGF mRNA表达,BMSC 2组>BMSC 1组>模型组>正常对照组(均P<0.05)。结论适量的BMSC尾静脉输注能有效减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化,而过量的BMSC则可能使其病变加重。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 肺纤维化 量效关系 红色荧光蛋白 肺表面活性物质蛋白 羟脯氨酸 转化生长因子-β 血小板衍生生长因子
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