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美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
1
作者 孔文迪 陈曦 +1 位作者 杨金先 葛均青 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期358-365,共8页
为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出... 为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。 展开更多
关键词 美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV) 普通pcr 荧光定量pcr SYBR GreenⅠ 检测方法
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副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
2
作者 平宇明 张宏莉 +8 位作者 班亚星 刘建奇 任希恩 邬彩丽 刘东霞 徐丽媛 杨雪娇 常华 李劼 《动物医学进展》 北大核心 2024年第7期1-6,共6页
为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏... 为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最低检测限为5拷贝/μL;重复试验中批内和批间变异系数均小于4%;与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体、肺炎克雷伯菌和曼氏杆菌等病原检测无交叉反应,能特异性检出MAP。应用建立的qPCR开展了内蒙古自治区6个市的MAP临床样品检测和流行情况分析,结果显示MAP平均阳性率为0.85%(6/704)。结果表明,成功建立了MAP的实时荧光定量PCR检测方法,可用于临床中MAP的监测和调查,为MAP疾病诊断与监控提供了快捷的方法。 展开更多
关键词 副结核分支杆菌 实时荧光定量pcr 检测方法 感染调查
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实时荧光定量PCR检测猴痘病毒的方法研究
3
作者 冯俊霞 陈锦峰 +3 位作者 崔晓虎 夏语嫣 薛冠华 袁静 《遵义医科大学学报》 2024年第5期508-512,521,共6页
目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立猴痘病毒RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测;对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核... 目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立猴痘病毒RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测;对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核酸进行检测,对RT-PCR方法检测临床样本能力进行评价。结果本研究建立的RT-PCR检测方法可实现猴痘病毒的特异性检测,与天花、痘苗、牛痘等其他正痘病毒无交叉反应,检测重复性好,最低检测限为103copies/μL。可以对人皮肤拭子样本中的猴痘病毒进行准确检测。结论本研究建立了猴痘病毒的RT-PCR检测方法,可在临床样本中快速、特异、灵敏的检测猴痘病毒。 展开更多
关键词 猴痘病毒 实时荧光定量pcr 快速检测方法 F3L基因
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高危型HPV感染临床检验中实时荧光定量PCR检测法的作用
4
作者 石诗雨 《实用妇科内分泌电子杂志》 2024年第19期104-106,共3页
目的分析高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染临床检验中实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测法的作用。方法选取80例疑似高危型HPV感染患者,均接受第二代杂交式捕获法(HCⅡ)、实时荧光定量PCR检测,以病理检查结果为金标准,分析实时荧光定量PC... 目的分析高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染临床检验中实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测法的作用。方法选取80例疑似高危型HPV感染患者,均接受第二代杂交式捕获法(HCⅡ)、实时荧光定量PCR检测,以病理检查结果为金标准,分析实时荧光定量PCR检测价值。结果实时荧光定量PCR检验准确率97.50%、敏感度98.51%、特异度92.31%,均显著高于HCⅡ的78.75%、88.06%、38.46%(P<0.05);实时荧光定量PCR诊断检出率CINⅠ100%、慢性宫颈炎92.31%,均显著高于HCⅡ的88.10%、46.15%(P<0.05)。结论应用实时荧光定量PCR检测法可明显提高高危型HPV感染患者的临床检验准确性,提高治疗方法的针对性。 展开更多
关键词 高危型人乳头瘤病毒感染 临床检验 实时荧光定量pcr检测法 准确性
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鳗鲡圆环病毒SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用
5
作者 林而舒 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2023年第3期54-61,共8页
为建立鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据EeCV复制相关蛋白(replication-associated protein,RAP)基因的保守序列设计特异性引物,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。qPCR的... 为建立鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据EeCV复制相关蛋白(replication-associated protein,RAP)基因的保守序列设计特异性引物,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。qPCR的阈值循环数(Cycle threshold value,C t值)与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广(1.0×108~102拷贝数/μL);可特异性检测EeCV,而对鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus)、猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duck circovirus)无扩增;重复性强,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏性高于普通PCR法10倍。且qPCR检测后发现,在感染EeCV的鳗鲡体内重要器官均可检测到EeCV,其中鳃的病毒量显著高于其他组织;对保存的44份疑似鳗鲡病毒性感染病料进行检测,阳性检出率为98%,而普通PCR法的阳性检出率为73%。 展开更多
关键词 鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus) 荧光定量pcr SYBR GreenⅠ 检测方法
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番茄环纹斑点病毒(TZSV)实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4
6
作者 徐弢 郑雪 +7 位作者 张晓林 陈永对 穆野 陈勇 郑宽瑜 赵立华 刘小烛 张洁 《山东农业科学》 2017年第7期139-144,共6页
本研究根据番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)保守N基因(Gen Bank登录号:13YV639)设计一对特异性引物,通过优化反应条件和反应体系,构建了TZSV的SYBR Green RT-qPCR检测方法。该方法稳定可靠,组内和组间的变异系数都小于... 本研究根据番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)保守N基因(Gen Bank登录号:13YV639)设计一对特异性引物,通过优化反应条件和反应体系,构建了TZSV的SYBR Green RT-qPCR检测方法。该方法稳定可靠,组内和组间的变异系数都小于2%;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.39和0.996,扩增效率为97.44%;最低能检测到1.07×10~4copies/μL的阳性质粒,灵敏度为常规PCR的1 000倍。同时利用构建的RT-qPCR方法检测TSWV、TNSa V、PCSV和TZSV四种病毒,只有TZSV有特异扩增曲线,表明该方法特异性良好。本研究构建的RT-qPCR方法能够为TZSV的早期预警与动态监测提供可靠的技术支撑。 展开更多
关键词 番茄环纹斑点病毒 实时荧光定量pcr 检测方法
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木尔坦棉花曲叶病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法 被引量：3
7
作者 赵蕊 吕利华 +2 位作者 陈婷 何自福 何余容 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期87-90,共4页
【目的】木尔坦棉花曲叶病毒Cotton Leaf Curl Multan Virus(CLCuMV)是为害锦葵科植物的重要双生病毒之一,本研究的目的是建立CLCuMV定量检测方法,为进一步研究其在寄主植物内的增殖动态、在介体昆虫内循环和其与寄主、介体间互作机制... 【目的】木尔坦棉花曲叶病毒Cotton Leaf Curl Multan Virus(CLCuMV)是为害锦葵科植物的重要双生病毒之一,本研究的目的是建立CLCuMV定量检测方法,为进一步研究其在寄主植物内的增殖动态、在介体昆虫内循环和其与寄主、介体间互作机制提供技术手段.【方法】以纯化的含CLCuMV基因组的质粒为模板,利用SYBR Green I荧光定量PCR对不同浓度的质粒样品进行CLCuMV扩增,制作标准曲线.依照建立的标准曲线,计算烟粉虱Bemisia tabaci及朱槿Hibiscus rosa-sinensis中CLCuMV的含量.【结果和结论】该定量检测法可检测到低浓度(5.2×101μL-1)的CLCuMV,其灵敏度是常规PCR的10倍,可被用于在寄主植物和介体昆虫体内CLCuMV的定量检测. 展开更多
关键词 木尔坦棉花曲叶病毒 锦葵科 SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量pcr 检测方法
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移植术常见病原体检测的多联qPCR法的建立与初步应用
8
作者 梁珊 吴潇潇 +4 位作者 高瞻 岳芮名 黄杨 刘安庆 何苗 《中国输血杂志》 CAS 2022年第5期494-500,共7页
目的 探讨多联实时荧光定量PCR(qPCR)应用于移植术中常见病原体检测的有效性。方法 选择临床移植术后常见的24种感染病原体,设计qPCR检测体系的引物探针序列,以每种病原体的标准质粒做qPCR反应验证;优化本实验中每种病原体反应体系的引... 目的 探讨多联实时荧光定量PCR(qPCR)应用于移植术中常见病原体检测的有效性。方法 选择临床移植术后常见的24种感染病原体,设计qPCR检测体系的引物探针序列,以每种病原体的标准质粒做qPCR反应验证;优化本实验中每种病原体反应体系的引物探针效果及浓度,分析确定qPCR方法的灵敏度、相关系数(R^(2))、扩增效率(E)后,用四川省人民医院移植ICU提供的肝肾移植患者标本22例做检测体系的应用验证:提取标本的总核酸100μL/(人)份,均分为二,分别以多联qPCR反应体系检测,以高通量测序方法(NGS)分析微生物种类;同时对移植患者的标本2 mL/份做微生物培养法检测。比较3种检测方法的检测结果,将NGS法作为金标准,分析多联qPCR法的阳性检出率,及其与培养法和NGS检测结果的差异。结果 所建立的qPCR检测体系24种病原体的qPCR检测下限均达到10^(1)cp/μL,均为R^(2)>0.99;对临床肝肾移植患者标本的病原体阳性检出率59.1%(13/22),NGS法相应为63.6%(14/22)(P>0.05)、微生物培养法为18.2%(4/22)(P<0.05)。检出的病原体比例:人类疱疹病毒6型(HHV-6) 30.8%(4/13)、巨细胞病毒(HCMV) 23.1%(3/13)、EB病毒(EBV)23.1%(3/13)、人细小病毒B19 15.4%(2/13)、流感嗜血杆菌(Hin)15.4%(2/13)、屎肠球菌(Efm)15.4%(2/13)、艰难梭菌(Cd)15.4%(2/13)、大肠杆菌(Eco)7.7%(1/13)、嗜麦芽窄食单胞菌(Sma) 7.7%(1/13)、肺炎克雷伯菌(Kpn)7.7%(1/13)、粪肠球菌(Efa)7.7%(1/13)、肺炎链球菌(Spn)7.7%(1/13)。3种方法的病原体检出一致率32%(7/22),其中多联qPCR法和NGS法的一致率为59%(13/22)和培养法的一致率41%(9/22)。结论 相较于微生物培养法,多联qPCR法对临床移植术中常见病原体的检测灵敏度高、定量准确、用时短、成本低;多联qPCR法结合NGS法、培养法有助于临床快速判断患者移植术后病原体感染状况。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 移植术病原体 多联检测 高通量测序 微生物培养法
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基于实时荧光定量PCR的番木瓜多重PCR高效检测方法 被引量：1
9
作者 张玉山 陈洁彬 +3 位作者 吴亮君 朱璇 欧阳淑芬 沈志华 《湖北农业科学》 2023年第9期170-174,共5页
以pCaMV35S基因核酸检测试剂盒反应体系为基础,添加多重PCR反应所需的目标基因引物和番木瓜(Carica papaya L.)DNA,进行多重PCR反应,同时考察不合成荧光探针的情况下对目标基因进行实时荧光定量检测。结果表明,在实时荧光定量PCR反应体... 以pCaMV35S基因核酸检测试剂盒反应体系为基础,添加多重PCR反应所需的目标基因引物和番木瓜(Carica papaya L.)DNA,进行多重PCR反应,同时考察不合成荧光探针的情况下对目标基因进行实时荧光定量检测。结果表明,在实时荧光定量PCR反应体系中,多重PCR扩增的基因条带比常规PCR扩增的基因条带更亮,在不合成荧光探针的情况下实现目标基因的实时荧光定量PCR反应,以期建立一种基于实时荧光定量PCR的多重PCR检测方法。 展开更多
关键词 转基因番木瓜(Carica papaya L.) 多重pcr反应 实时荧光定量pcr 荧光探针 pCaMV35S基因核酸检测试剂盒(pcr-荧光探针法)
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