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兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析 被引量:20
1
作者 刘怀然 陈洪岩 +4 位作者 关云涛 王云峰 李昌文 夏长友 张立成 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期321-324,共4页
自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为A... 自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为AF45 376 1)。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明 :各毒株间核苷酸的同源性为 91%~ 98% ,氨基酸同源性为 94%~ 99% ,氨基酸变异多发生在高变区 ,进一步证明了毒株的高度保守性 ,为明确我国RHDV地方株VP6 0蛋白的分子特征。 展开更多
关键词 出血症 病毒 衣壳蛋白 VP60 基因克隆 序列分析
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兔出血症病毒胶体金免疫层析试纸条诊断方法的建立及初步应用 被引量:18
2
作者 蔡少平 王芳 +6 位作者 贾华敏 张海彬 李超美 范志宇 胡波 熊富强 魏后军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1795-1801,共7页
为了建立一种快速、简便的兔出血症病毒(RHDV)的检测方法,用胶体金标记纯化的RHDV多克隆抗体,以杆状病毒表达系统表达的重组RHDV VP60蛋白为免疫原制备RHDV的单克隆抗体(McAb,简称单抗)A3C,将RHDV McAb和羊抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维素... 为了建立一种快速、简便的兔出血症病毒(RHDV)的检测方法,用胶体金标记纯化的RHDV多克隆抗体,以杆状病毒表达系统表达的重组RHDV VP60蛋白为免疫原制备RHDV的单克隆抗体(McAb,简称单抗)A3C,将RHDV McAb和羊抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化研制成RHDV免疫胶体金试纸条。该试纸条可以检出红细胞凝集试验(HA)效价为1∶10的RHDV悬液,即HA检测为阴性的样品,该试纸条检测为阳性,其敏感性高于HA;特异性试验结果显示,该试纸条不与家兔其他常见病菌发生交叉反应。应用该试纸条对127份疑似兔出血症家兔肝脏样品进行初步检测,同时用HA做平行试验,阳性符合率为100%。因此,该试纸条是一种快速、灵敏、特异的兔出血症病毒检测方法,为兔出血症的现场诊断提供了有效的方法,显示出很好的临床应用前景。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 VP60蛋白 单克隆抗体 胶体金免疫层析试验 红细胞凝集试验
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兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析 被引量:14
3
作者 严维巍 崔治中 王永坤 《中国病毒学》 CSCD 2003年第2期129-133,共5页
应用RT-PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1.7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEMR-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因... 应用RT-PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1.7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEMR-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1 740bp,共编码580个氨基酸。该核酸序列与其它国家报道的多株RHDV序列相互间同源性高达98.2%~99.0%,其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%~99.1%,为极度保守片段。 展开更多
关键词 出血症病毒 中国株 衣壳蛋白基因 基因克隆 序列分析 RT-PCR 出血症
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兔出血症病毒双夹心ELISA检测方法的建立 被引量:15
4
作者 董婷 王芳 +5 位作者 熊富强 王先炜 范志宇 胡波 王敏敏 李洪广 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第3期571-576,共6页
为建立特异性好、敏感度高、稳定可靠的检测兔出血症病毒的双夹心ELISA方法。该试验制备了兔出血症病毒多抗和小鼠腹水单抗,并将他们提纯。用方阵法筛选最佳反应浓度,用特异性试验、敏感度试验和重复性试验对该方法进行鉴定,并同时用双... 为建立特异性好、敏感度高、稳定可靠的检测兔出血症病毒的双夹心ELISA方法。该试验制备了兔出血症病毒多抗和小鼠腹水单抗,并将他们提纯。用方阵法筛选最佳反应浓度,用特异性试验、敏感度试验和重复性试验对该方法进行鉴定,并同时用双夹心ELISA和血凝试验(HA)对52份待测兔肝脏样品进行检测,比较这两种方法的符合率。结果显示:兔出血症病毒多抗最佳稀释度为1∶400,浓度为19.50 mg/L;单抗的最佳稀释度为1∶800,浓度为2.86 mg/L。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法特异性强、敏感度高。对52份待检兔肝脏样品的检测结果显示:双夹心ELISA和HA试验的阳性检出率分别为82.7%(43/52)和75.0%(39/52),双夹心ELISA与HA试验的符合率为90.7%。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。以上试验结果表明该双夹心ELISA方法是检测RHDV的一种特异、敏感、快速、经济的免疫学检测技术。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 双夹心ELISA 多抗 单抗
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兔出血症病毒血凝试验及血凝抑制试验影响因素的探讨 被引量:12
5
作者 巩薇 卫礼 +2 位作者 付瑞 贺争鸣 邢瑞昌 《实验动物科学与管理》 2003年第3期7-10,共4页
目的 探讨影响血凝、血凝抑制实验结果的各种可能因素。方法 比较 7种微量反应板在不同稀释系统和不同血清处理方法情况下进行血凝和血凝抑制试验的结果。结果 找出了图谱清晰 ,反应结果规律、稳定的实验条件。结论 为我国国标的进... 目的 探讨影响血凝、血凝抑制实验结果的各种可能因素。方法 比较 7种微量反应板在不同稀释系统和不同血清处理方法情况下进行血凝和血凝抑制试验的结果。结果 找出了图谱清晰 ,反应结果规律、稳定的实验条件。结论 为我国国标的进一步完善提供了实验依据。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 血凝试验 血凝抑制试验 检测方法 传染病
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检测兔出血症病毒抗体间接ELISA方法的建立 被引量:15
6
作者 李超美 王芳 +5 位作者 蔡少平 任雪枫 胡波 范志宇 徐为中 何孔旺 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第3期546-550,共5页
为建立检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法,应用杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被浓度为4.62μg/ml,标准阴、阳性血清稀释度为1∶200,封闭液选用2%明胶;羊抗兔IgG... 为建立检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法,应用杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被浓度为4.62μg/ml,标准阴、阳性血清稀释度为1∶200,封闭液选用2%明胶;羊抗兔IgG最佳稀释度为1∶4 000。阻断试验、特异性试验、敏感性试验、重复性试验结果显示,该方法具有较高的特异性、敏感性和重复性。用建立的ELISA方法与血凝抑制试验对临床血清样品进行检测,结果显示,ELISA与HI检测兔血清的RHDV抗体阳性率分别为84.7%(955/1 127)和76.0%(857/1 127),符合率为91.3%。该方法的建立为检测RHDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、快速、操作简便经济的检测方法,为兔出血症免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 VP60 间接ELISA
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兔病毒性出血症病毒基因组3′端非编码区的分子克隆及生物信息学分析 被引量:12
7
作者 刘光清 张玉颖 +7 位作者 云涛 倪征 张淼涛 梁华丽 华炯刚 李双茂 杜青云 盛祖恬 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2006年第3期16-20,25,共6页
采用3′RACE方法对兔病毒性出血症病毒(RHDV)JX/CHA/97株基因组3′端全序列进行了扩增、克隆和测序,并利用ONAstar和DNAman软件分析了RHDV JX/CHA/97株与各参比毒株3′NCR的序列同源性,用RNA structure软件对3′NCR的二级结构进行... 采用3′RACE方法对兔病毒性出血症病毒(RHDV)JX/CHA/97株基因组3′端全序列进行了扩增、克隆和测序,并利用ONAstar和DNAman软件分析了RHDV JX/CHA/97株与各参比毒株3′NCR的序列同源性,用RNA structure软件对3′NCR的二级结构进行了预测和分析。结果表明,所扩增的目的基因片段长1500 bp,包括部分VP60基因序列、ORF2基因、3′端非编码区(3′Non Coding Region,3′NCR)和poly(A)尾巴,其中 3′NCR位于ORF2终止密码子TAG之后,长59 bp,poly(A)至少含有27个A;3′NCR序列具有较高的同源性 (93.5%-100%);3′NCR二级结构可以形成2个潜在的茎-环结构(SL1和SL2),其中SL2具有一定的保守性,其形状和形成位置与poly(A)尾巴的长度关系不大,但是SL1的结构和形成位置与poly(A)尾巴的存在与否密切相关,提示poly(A)尾巴与3′NCR高级结构的稳定性以及基因组复制有一定关系。 展开更多
关键词 兔病毒性出血症病毒 3’端非编码区 POLY(A) 二级结构 生物信息学
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兔出血症病毒与欧洲野兔综合征病毒复合RT-PCR检测方法的建立 被引量:13
8
作者 王印 杨泽晓 +3 位作者 韩雪清 汪开毓 姚学萍 白瑜 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1165-1170,共6页
为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构... 为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构建的重组质粒pGM-T-EBHSV和RHDV RT-PCR产物构建的pGM-T-RHDV为模板,经过反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,初步建立了RHDV和EBHSV的复合RT-PCR检测方法,并对20份临床样品和5份RHDV人工感染样品进行了检测。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和EBHSV的特异性目的片段192bp和335bp,对2种病毒的检测限度均可达到50copies的目的基因片段,兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌和沙门氏菌核酸扩增均为阴性。样品检测结果显示,5份人工感染样品的RHDV检出率为100%,20份临床样品的RHDV检测为阴性。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 欧洲野兔综合征病毒 反转录-聚合酶链反应 重叠延伸PCR
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兔出血症病毒分子生物学研究进展 被引量:11
9
作者 张玉颖 刘光清 吴润 《动物医学进展》 CSCD 2006年第3期9-13,共5页
兔出血症是由兔出血症病毒引起的一种急性、高度致死性传染病,病死率可高达100%,给养兔业带来了巨大的经济损失。近年来,随着对其研究的不断深入,在病毒分子生物学方面取得了很大的进展。文章主要从基因组结构及功能、编码的结构蛋白与... 兔出血症是由兔出血症病毒引起的一种急性、高度致死性传染病,病死率可高达100%,给养兔业带来了巨大的经济损失。近年来,随着对其研究的不断深入,在病毒分子生物学方面取得了很大的进展。文章主要从基因组结构及功能、编码的结构蛋白与非结构蛋白、基因疫苗等方面系统阐述了兔出血症病毒分子生物学方面的研究进展,同时,提出了存在的问题和展望。为进一步研制兔出血症病毒基因工程疫苗及诊断试剂提供理论基础,以期能更有效地防治此病。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 分子生物学
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兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析 被引量:10
10
作者 田浪 王红宁 +3 位作者 李建文 廖娟 张夏兰 王鸿宾 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2005年第12期983-987,共5页
采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒(RHDV)Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90... 采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒(RHDV)Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%~97.5%,氨基酸同源性为94.3%~99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析. 展开更多
关键词 兔出血症病毒 衣壳蛋白 VP60基因 序列分析
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兔出血病病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:9
11
作者 胡迎东 刘怀然 +4 位作者 司昌德 刘家森 韩凌霞 姜骞 曲连东 《动物医学进展》 CSCD 2006年第5期87-90,共4页
为快速检测兔出血病病毒,参照RHDV-TP株VP60基因序列(GenBank Ac-ession AF453761),在其5′端设计一对引物,扩增片段为386 bp,建立了检测兔出血病病毒的RT-PCR检测方法。经过对反应参数的优化,确定了反应的最佳条件。该方法在含多种已... 为快速检测兔出血病病毒,参照RHDV-TP株VP60基因序列(GenBank Ac-ession AF453761),在其5′端设计一对引物,扩增片段为386 bp,建立了检测兔出血病病毒的RT-PCR检测方法。经过对反应参数的优化,确定了反应的最佳条件。该方法在含多种已知病原的病料中,可特异性检出RHDV,检测病料的最高稀释度为10-5倍,且有很好的稳定性。临床样品检测结果显示,该方法的敏感性要高于血凝抑制试验,从而建立了RHDV特异、敏感的RT-PCR检测技术,可应用于RHDV临床诊断及流行病学调查。 展开更多
关键词 兔出血病病毒 RT-PCR 病原学检测
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兔出血症病毒和巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用 被引量:11
12
作者 刘梅 吴健敏 +2 位作者 黄红梅 白安斌 陈凤莲 《畜牧与兽医》 北大核心 2012年第5期21-25,共5页
参照GenBank公布的兔出血症病毒(RHDV)VP60、巴氏杆菌kmt基因序列,设计两对引物,分别用于扩增RHDV的VP60和巴氏杆菌kmt基因的目的片段。通过正交试验,对反应各组分浓度与组合、反应退火温度及反应参数进行优化,最后建立了RHDV、巴氏杆... 参照GenBank公布的兔出血症病毒(RHDV)VP60、巴氏杆菌kmt基因序列,设计两对引物,分别用于扩增RHDV的VP60和巴氏杆菌kmt基因的目的片段。通过正交试验,对反应各组分浓度与组合、反应退火温度及反应参数进行优化,最后建立了RHDV、巴氏杆菌双重PCR检测方法并进行临床应用。结果显示:本试验建立的双重PCR检测方法能够特异性地检测RHDV及巴氏杆菌,最低核酸检出限分别达到70 pg和62pg。检测兔源大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌,结果均为阴性。用本方法对临床送检的104份病料进行检测,结果检出RHDV与巴氏杆菌混合感染1份,巴氏杆菌单独感染10份,双重PCR检测结果与临床病原分离结果完全一致。表明本试验建立的兔出血症病毒和巴氏杆菌双重PCR检测方法具有良好的临床应用价值。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 巴氏杆菌 双重PCR
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兔出血症病毒抗体的实验室检测能力验证结果评价 被引量:11
13
作者 付瑞 王洪 +4 位作者 王淑菁 李晓波 王吉 卫礼 岳秉飞 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期188-190,198,共4页
目的通过兔出血症病毒抗体检测能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,通过筛选血清制备样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加... 目的通过兔出血症病毒抗体检测能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,通过筛选血清制备样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果来自14个省市自治区的20个实验室报名参加本次比对实验,均在规定时间内反馈了检测结果,17个实验室检测结果为合格或优秀,占参加比对实验室的85%。在20个实验室中,14个实验室采用了酶联免疫吸附实验(ELISA)方法,6个实验室采用血凝抑制实验(HAI)方法。结论全国各实验动物检测机构兔出血症病毒抗体总体检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 能力验证 酶联免疫吸附实验 血凝抑制实验
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检测兔出血症病毒抗体胶体金试纸条的研制及初步应用 被引量:9
14
作者 魏后军 范志宇 +6 位作者 王芳 宋艳华 胡波 仇汝龙 陈萌萌 徐为中 薛家宾 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期614-619,共6页
利用免疫层析技术建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的方法,将胶体金标记重组RHDV VP60蛋白,抗VP60单抗A3C和金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)分别包被质控线(C线)和检测线(T线),通过检测强阳性、阳性、弱阳性、阴性血清优化试纸条制备条件,... 利用免疫层析技术建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的方法,将胶体金标记重组RHDV VP60蛋白,抗VP60单抗A3C和金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)分别包被质控线(C线)和检测线(T线),通过检测强阳性、阳性、弱阳性、阴性血清优化试纸条制备条件,并验证其性能及与血凝抑制试验的符合率。结果显示,试纸条检测阳性血清时T线、C线颜色深度相同,强阳性血清T线比C线颜色深,弱阳性血清T线比C线颜色浅,阴性血清T线不显色、C线显色,检测强阳性、阳性、弱阳性、阴性血清与血凝抑制试验的符合率分别为93.75%、88.75%、91.25%、95.00%,总的符合率为91.54%;该试纸条具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,为兔病毒性出血症流行病学调查和抗体水平监测提供了有力的检测工具。 展开更多
关键词 兔病毒性出血症 兔出血症病毒 VP60 胶体金试纸条 抗体
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在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白 被引量:7
15
作者 严维巍 崔治中 王永坤 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期333-337,共5页
将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60。在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经... 将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60。在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUE BAC4-VP60。以重组杆状病毒感染Sf9细胞后,收获细胞培养上清和细胞裂解液上清,SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒pBLUEBAC4-VP60表达一分子量各为60kD左右的特异性重组蛋白,并且该重组蛋白经Westernblot检测,皆可被兔抗RHDV高免血清所识别,表明VP60蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中得到了表达,并且具有与天然VP60相似的抗原性。血凝试验表明,表达的重组蛋白具有血凝特性,可以凝集人"O"型红细胞,血凝价为213。同时,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察,重组病毒表达的衣壳蛋白可以在没有其他任何成分存在的条件下,在昆虫细胞内也能自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(VLPs)。在与兔抗RHDV高免血清37℃作用1h后,该病毒样颗粒于电镜下观察可出现凝集成团的现象,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似。 展开更多
关键词 表达 昆虫细胞 病毒样颗粒 重组杆状病毒 衣壳蛋白 VLP 重组蛋白 转移载体 高免血清 兔出血症病毒
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Rescued virus from infectious cDNA clone of rabbit hemorrhagic disease virus is adapted to RK13 cells line 被引量:9
16
作者 LIU Guangqing NI Zheng +7 位作者 YUN Tao ZHANG Yuying DU Qingyun SHENG Zutian LIANG Huali HUA Jionggang LI Shuangmao Chen Jianping 《Chinese Science Bulletin》 SCIE EI CAS 2006年第14期1698-1702,共5页
Based on the infectious full-length cDNA clone of rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV), the in vitro transcripts are introduced into RK13 cells. 12 h later, CPE could be observed clearly, and virual antigen could a... Based on the infectious full-length cDNA clone of rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV), the in vitro transcripts are introduced into RK13 cells. 12 h later, CPE could be observed clearly, and virual antigen could also be detected by IFA. The titre of the recovered virus is 104.6/mL. Immune electron micro-scopic observation of the virus particles revealed that the particles were rotund with a diameter of about 30 nm. Besides, virus titre quantification obtained by qRT-PCR showed a correlation between time from infection and virus titre. All these results showed that we have recovered RHDV from RK13 cells by re-verse genetics technology successfully, and this would be very useful in studies of the antigenicity, virulence, pathogenesis, maturation and new type vaccines of RHDV. 展开更多
关键词 兔出血性疾病 RHDV 反求遗传学 RK13细胞 CDNA
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一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析 被引量:10
17
作者 田浪 王红宁 +4 位作者 李建文 廖娟 张夏兰 周万蓉 王鸿宾 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1078-1083,共6页
从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒(RHDV),命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性;但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成... 从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒(RHDV),命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性;但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线;电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序,序列分析表明VP60基因序列全长1740bp,编码579个氨基酸,测序结果提交GenBank(注册号为DQ069280),并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较,结果表明核苷酸同源性为90.0%~98.0%,氨基酸同源性为94.1%~99.0%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区;同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株,丰富了地方毒株资源,为明确我国地方株的分子流行病学,以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 无血凝性 衣壳蛋白 VP60基因 序列分析 RT—PCR
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兔出血症病毒遗传变异分析及RT—PCR检测方法的建立 被引量:10
18
作者 刘月环 楼琦 +2 位作者 金晓音 郭红刚 石巧娟 《中国比较医学杂志》 CAS 2008年第11期44-49,共6页
目的获得兔出血症病毒(浙江分离株)近20年间遗传变异概况,建立兔出血症病毒的RT—PCR检测方法。方法对1989~2006年间的7株RHDV浙江分离株的衣壳蛋白基因(VP60)进行了克隆与测序,并与国内、外RHDV的基因组序列进行了遗传比对和分析... 目的获得兔出血症病毒(浙江分离株)近20年间遗传变异概况,建立兔出血症病毒的RT—PCR检测方法。方法对1989~2006年间的7株RHDV浙江分离株的衣壳蛋白基因(VP60)进行了克隆与测序,并与国内、外RHDV的基因组序列进行了遗传比对和分析;根据兔出血症病毒株的VP60设计引物,对20只人工感染兔的实质脏器、全血和350只实验兔全血样本进行了检测。结果7株RHDV的VP60基因均由1740个核苷酸组成,编码580个氨基酸。它们与参考序列之间的氨基酸同源性为94.0%~99.8%。系统发生树分析结果显示,RHDV可划分为2个大的基因群,浙江(中国)的RHDV分离株主要集中于C亚群。RT—PCR检测方法表明20只实验兔全部扩出预期条带,而350只实验兔全血检测中出现13只RHDV可疑样本。经血凝抑制试验检测,13例PCR阳性样品中有10个HAI阳性,3个阴性。检测敏感度达100%,特异性为99.12%,经统计检验,kappa=0.865,表明PCR检出RHDV的结果与HAI高度一致。结论RHDV基因群之间的遗传距离有逐渐加大的趋势。我们建立的RT—PCR法可用于RHDV浙江分离株的检测,用RT—PCR检测全血中RHDV方法的建立为活体检测RHDV打下了基础。 展开更多
关键词 兔病毒性出血症病毒 衣壳蛋白基因 遗传变异 RT—PCR
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环介导等温扩增技术在兔出血症病毒检测中的应用 被引量:8
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作者 原冬伟 刘家森 +4 位作者 郭东春 姜骞 林欢 司昌德 曲连东 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期390-395,共6页
根据GenBank中的中国兔出血症病毒(RHDV)分离株VP60基因保守序列设计合成了内、外2对引物,在Bst DNA聚合酶的作用下完成等温核酸扩增反应,对反应条件逐一优化,并对临床样品进行检测。结果表明,该方法简便、快速、特异性好,灵敏性较常规... 根据GenBank中的中国兔出血症病毒(RHDV)分离株VP60基因保守序列设计合成了内、外2对引物,在Bst DNA聚合酶的作用下完成等温核酸扩增反应,对反应条件逐一优化,并对临床样品进行检测。结果表明,该方法简便、快速、特异性好,灵敏性较常规反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)高100倍。该方法可同时扩增7株RHDV中国分离株,说明其对检测国内RHDV分离株的有效性。对15份临床样品的检测结果显示,环介导等温扩增(LAMP)阳性检出率达80%,RT-PCR检测阳性率为60%。该LAMP方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速、不需要复杂仪器设备、便于肉眼观察等优点,可作为临床检测RHDV的新方法,适合国内基层和实验室对RHDV的快速检测,具有广泛的推广应用价值。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 环介导等温扩增 病毒检测
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鉴别RHDV与RHDV2荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量:5
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作者 肖跃强 孙培姣 +7 位作者 周迎春 陈萌萌 崔平 杨慧 于雪 于新友 王芳 沈志强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期512-520,共9页
为建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的鉴别检测兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究选择RHDV与RHDV2 VP60基因序列高度同源的保守区域设计了3对引物,经荧光定量PCR扩增比较,筛选出1... 为建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的鉴别检测兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究选择RHDV与RHDV2 VP60基因序列高度同源的保守区域设计了3对引物,经荧光定量PCR扩增比较,筛选出1对引物,对各反应条件进行优化,建立了RHDV与RHDV2荧光定量PCR检测方法,且基于RHDV较RHDV2扩增产物熔解曲线Tm值高1.57℃~2.74℃,能够达到鉴别检测的目的。特异性试验显示,该方法仅对RHDV和RHDV2检测为阳性,对猪瘟兔化弱毒、兔多杀性巴氏杆菌、A型魏氏梭菌、波氏杆菌检测均为阴性,特异性强。敏感性试验显示,该方法对RHDV与RHDV2 VP60基因重组质粒标准品的最低检测限均为1×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;重复性试验显示,RHDV VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.91、3.60,Tm值最大变异系数分别小于0.72、0.48;RHDV2 VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.90、3.93,Tm值最大变异系数分别为0.29、0.17,均小于5%,重复性好。采集RHDV AV34株感染病死兔的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心肌组织、内皮组织、口鼻粘液、肌肉组织、肛门排泄物、尿液等组织样品,进行病毒组织分布与排毒的检测,结果显示,各组织样品均为阳性,表明病毒在体内分布广泛,病毒可通过口鼻分泌物及粪尿排泄物排出。利用该方法检测临床肝组织样品,结果显示,RHDV AV34标准株阳性肝组织与14份RHDV临床肝组织样品、RHDV2分离株SC2020/04感染样品均为阳性,而常规RT-PCR方法对其中1份RHDV临床肝组织样品检测为阴性,两种方法符合率为93.3%。本研究建立了一种能够鉴别检测RHDV与RHDV2的荧光定量RT-PCR方法,为开展兔病毒性出血症的临床诊断、流行病学调查与防控等提供了有效的技术保障。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 兔出血症病毒2型 荧光定量RT-PCR 鉴别
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