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题名应用于基因编辑的核糖核蛋白复合体的构建与活性验证
被引量：2
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作者
高伟欣
黄火清
赵晶
张鑫
杨宁
杨浩萌
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机构
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
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出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第8期60-68,共9页
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基金
国家重点研发计划(2021YFC2100204)。
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文摘
CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、成本低廉和编辑效率高等优点,已经被广泛应用于动物、植物、微生物的基因编辑研究。在该技术体系中,发挥核酸剪切功能的是Cas9蛋白和guideRNA(gRNA)组装而成的核糖核蛋白复合体,即RNP(ribonucleoprotein)复合体。目前,应用体外组装的RNP复合体直接递送进入受体细胞进行基因编辑的研究越来越多,成为提高编辑效率、降低脱靶率的有效手段。本研究以获得具有高效剪切活性的RNP复合体为试验目的,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了Cas9蛋白,并通过His-tag亲和树脂对重组Cas9蛋白进行了纯化;同时,通过T7转录试剂盒对gRNA进行体外转录和纯化,使纯化的Cas9蛋白和gRNA自发组装成RNP复合体,经体外活性检测,RNP复合体具有很好的DNA双链剪切活性;将其与donor DNA共同转化到黑曲霉菌株,成功敲除了目标蛋白,编辑效率达到90%以上。本研究获得的RNP复合体,可以应用于丝状真菌的基因编辑,节约了试验时间与成本,并推动RNP介导的基因编辑技术在更多领域的应用。
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关键词
Cas9蛋白
rnp复合体
大肠杆菌
活性验证
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Keywords
Cas9 protein
rnp complex
Escherichia coli
activity detection
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分类号
Q78
[生物学—分子生物学]
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