猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达 被引量：23

1

作者 姜丽华 卢海蓉 +3 位作者 黄德新 易俊波 李凌云 林枫 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期1036-1039,共4页

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD... PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut+表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。 展开更多

关键词 PBD-1 毕赤酵母 PPIC9K 分泌表达 抑菌活性

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抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达 被引量：20

2

作者 王秀青 张素芳 +2 位作者 曹瑞兵 周斌 陈溥言 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期120-123,共4页

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电... 通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵。经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性。 展开更多

关键词 天蚕素B 抗菌肽 毕赤酵母 表达 抑菌活性 重叠区扩增基因拼接法(SOE)

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在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究 被引量：7

3

作者 胡乔 赵凌侠 唐克轩 《上海交通大学学报（农业科学版）》 2008年第3期233-236,241,共5页

将化学合成的人溶菌酶基因hLYZ(444bp)构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用Sac I线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-P... 将化学合成的人溶菌酶基因hLYZ(444bp)构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用Sac I线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,重组hLYZ在毕赤酵母中成功表达,在诱导60h时表达量最高。用镍亲和层析柱纯化重组hLYZ,用Bradford法测得其含量约为324mg·L-1。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活性达到4473U·mL-1。本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶,并探索了简单有效的纯化和活性测定方法,为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。 展开更多

关键词 人溶菌酶 毕赤酵母 生物活性

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人ω干扰素基因工程菌发酵条件的优化 被引量：1

4

作者 郑成已 《海峡药学》 2006年第3期168-170,共3页

目的对表达人ω干扰素(in terferon,ωIFN-ω)的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得ω干扰素的最高表达量。方法设计三因素三水平正交实验方案,用直观分析法分析来确定出最佳的发酵条件。结果用FBS培养基... 目的对表达人ω干扰素(in terferon,ωIFN-ω)的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得ω干扰素的最高表达量。方法设计三因素三水平正交实验方案,用直观分析法分析来确定出最佳的发酵条件。结果用FBS培养基发酵的最佳条件是:温度28℃,溶氧50%,甲醇浓度1%,pH 7.0。结论通过发酵条件优化后,ω干扰素表达量达到了90m g.L-1。 展开更多

关键词 ω干扰素 巴斯德毕赤酵母 发酵 表达

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鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达 被引量：3

5

作者 张辉华 杨小梅 +3 位作者 谢青梅 马静云 曹永长 毕英佐 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期123-126,共4页

对鸡β-防御素-3(Gal-3)在毕赤酵母中的分泌表达进行了研究。以重组质粒Gal-3-T为模板,利用PCR技术扩增出Gal-3基因成熟肽片段,将该片段插入到酵母表达载体pPICZα-C,构建分泌型重组表达载体pPICZα-C-Gal-3,电转入表达宿主菌X-33毕赤酵... 对鸡β-防御素-3(Gal-3)在毕赤酵母中的分泌表达进行了研究。以重组质粒Gal-3-T为模板,利用PCR技术扩增出Gal-3基因成熟肽片段,将该片段插入到酵母表达载体pPICZα-C,构建分泌型重组表达载体pPICZα-C-Gal-3,电转入表达宿主菌X-33毕赤酵母,Zeocin抗性筛选重组菌株;挑取阳性菌株经甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4.5 kDa位置出现预期条带;对所表达的Gal-3进行抗菌活性检测,发现其具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌的活性。 展开更多

关键词 鸡β-防御素-3(Gallinacin-3) 毕赤酵母 分泌表达

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发酵工业中毕赤酵母表达的影响因素 被引量：3

6

作者 樊春媛 王雪 郎晓磊 《河北化工》 2012年第7期50-51,57,共3页

毕赤酵母是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统。综合论述了外源基因、启动子、拷贝数、诱导温度、pH值、通气量、甲醇诱导、蛋白酶等对毕赤酵母表达系统的影响,为毕赤酵母在工业生产中的实际应用提供参考。

关键词 毕赤酵母 外源蛋白 发酵工业 影响因素

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葡萄糖对组成型毕赤酵母发酵产α-葡聚糖酶的影响 被引量：1

7

作者 吴兆鹏 梁达奉 +3 位作者 黄曾慰 曾练强 黎志德 常国炜 《广西糖业》 2015年第6期16-21,共6页

本文主要考察葡萄糖对毕赤酵母生长和组成型表达α-葡聚糖酶的影响。采用单因素实验法考察初始发酵培养基中葡萄糖浓度、补料阶段葡萄糖残留、通气量等对α-葡聚糖酶产量的影响。结果表明发酵培养基中初始葡萄糖浓度50g/L最佳,提高初始... 本文主要考察葡萄糖对毕赤酵母生长和组成型表达α-葡聚糖酶的影响。采用单因素实验法考察初始发酵培养基中葡萄糖浓度、补料阶段葡萄糖残留、通气量等对α-葡聚糖酶产量的影响。结果表明发酵培养基中初始葡萄糖浓度50g/L最佳,提高初始葡萄糖浓度,毕赤酵母生长和α-葡聚糖酶产量都明显受到影响。补料过程葡萄糖残留越小越有利于酶的表达,最理想的控制应该是葡萄糖残留几乎为零,但又保证能满足菌体的生长和表达需要。提高通气量有利于增加α-葡聚糖酶的产量,发酵时间66h为宜。在优化条件下,α-葡聚糖酶酶活达16537U,为利用葡萄糖生产α-葡聚糖酶打下基础。 展开更多

关键词 毕赤酵母 α-葡聚糖酶 葡萄糖 发酵条件

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植酸酶毕赤氏酵母诱导条件初步研究

8

作者 洒荣波 宋枚枚 +1 位作者 王正祥 石贵阳 《泰山医学院学报》 CAS 2007年第9期696-698,共3页

目的优化产植酸酶的毕赤酵母基因工程菌的表达条件,确定最佳的诱导表达条件。方法先培养酵母细胞,然后进行诱导产酶,最后进行酶活测定。结果植酸酶的最佳收获时间为3 d;甲醇的最佳诱导浓度为10 g/L。结论在诱导开始之后加入0.4%的PTM1和... 目的优化产植酸酶的毕赤酵母基因工程菌的表达条件,确定最佳的诱导表达条件。方法先培养酵母细胞,然后进行诱导产酶,最后进行酶活测定。结果植酸酶的最佳收获时间为3 d;甲醇的最佳诱导浓度为10 g/L。结论在诱导开始之后加入0.4%的PTM1和0.1%酪蛋白水解物可以明显促进植酸酶的表达。 展开更多

关键词 巴斯德毕赤氏酵母 植酸酶 表达 优化

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风疹病毒E1—374糖蛋白生物活性检测及其初步应用 被引量：1

9

作者 李振梅 温红玲 +6 位作者 林彬 孙成玺 褚福禄 袁晓晶 宋艳艳 许洪芝 王志玉 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2013年第4期295-297,共3页

目的分泌表达风疹病毒E1-374糖蛋白并检测其免疫原性。方法将E1—374蛋白的cDNA插入表达载体pGAPZotA中构建出表达质粒pGAPZctA—E1—374，经BlnI酶线性化后通过电转的方法导入毕赤酵母菌，博来霉素筛选阳性菌落。间接免疫荧光和Western... 目的分泌表达风疹病毒E1-374糖蛋白并检测其免疫原性。方法将E1—374蛋白的cDNA插入表达载体pGAPZotA中构建出表达质粒pGAPZctA—E1—374，经BlnI酶线性化后通过电转的方法导入毕赤酵母菌，博来霉素筛选阳性菌落。间接免疫荧光和WesternBlot检测E1—374蛋白的表达及免疫反应性。免疫小鼠后应用间接ELISA检测风疹病毒IgG抗体。结果SDS-PAGE和WesternBlot显示E1-374蛋白的相对分子质量为46．89×10^3。ELISA法检测免疫小鼠的抗血清为阳性。建立的间接ELISA方法的最佳工作条件是抗原包被浓度为5．5μg／ml，血清最佳稀释度为1：100，板内变异系数值为0．36％-12．45％。结论E1-374蛋白能够引起小鼠体液免疫应答，是风疹亚单位疫苗的重要候选成分，并可应用于风疹病毒IgG抗体的检测。 展开更多

关键词 风疹病毒 蛋白质E1—374 毕赤酵母 酶联免疫吸附测定

原文传递

重组人甲状旁腺素1-34在毕赤酵母克隆及表达的研究

10

作者 崔珊珊 《长春师范大学学报（人文社会科学版）》 2012年第9期60-63,共4页

人甲状旁腺素(Parathyroid hormone,PTH)是由人甲状旁腺主细胞分泌的直链肽,含84个氨基酸,是维持体内钙磷平衡的主要激素。PTH通过识别骨骼、小肠和肾脏等细胞表面特异性受体,与降钙素和维生素D共同调节Ca2+,PO43-的代谢,具有明显的成... 人甲状旁腺素(Parathyroid hormone,PTH)是由人甲状旁腺主细胞分泌的直链肽,含84个氨基酸,是维持体内钙磷平衡的主要激素。PTH通过识别骨骼、小肠和肾脏等细胞表面特异性受体,与降钙素和维生素D共同调节Ca2+,PO43-的代谢,具有明显的成骨作用。研究发现,PTH的N-端34肽(PTH 1-34)具有完全的PTH受体结合能力与生物活性。目前PTH 1-34作为临床治疗骨质疏松症的注射剂已在美国上市,但价格昂贵且需要每天注射给药。而国内关于PTH1-34的临床研究很少,所以有必要通过基因工程手段获取PTH 1-34,降低成本并可大规模制备目的蛋白。本文概述了PTH近年来在国内外的研究情况,利用目前发展较快的毕赤酵母真核表达系统,构建了高效表达PTH 1-34毕赤酵母工程菌。为今后上发酵罐摸清条件。 展开更多

关键词 甲状旁腺素1-34 毕赤酵母 克隆 表达

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基因工程菌毕赤酵母发酵产纤维二糖酶条件研究

11

作者 王蕊 王林风 +2 位作者 闫德冉 赵子高 刘乐 《山东化工》 CAS 2015年第17期17-21,共5页

本文对基因工程菌毕赤酵母产纤维二糖酶活的发酵条件进行研究,结果表明:确定最优摇瓶培养基为小麦B浆4%,硫酸镁0.05%,玉米浆1%。其摇瓶最佳产酶条件为诱导时间12h,诱导前适宜的增殖时间为16h,接种量10%,转速220r/min,发酵pH值为6。在此... 本文对基因工程菌毕赤酵母产纤维二糖酶活的发酵条件进行研究,结果表明:确定最优摇瓶培养基为小麦B浆4%,硫酸镁0.05%,玉米浆1%。其摇瓶最佳产酶条件为诱导时间12h,诱导前适宜的增殖时间为16h,接种量10%,转速220r/min,发酵pH值为6。在此基础上进行了50L发酵罐发酵中试,50L发酵罐诱导产酶高达125U。 展开更多

关键词 毕赤酵母 纤维二糖酶 发酵

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人前列腺特异性抗原基因重组表达载体pPICZαC-mPSA的构建和表达(英文)

12

作者 邹冬辉 张家颖 +3 位作者 郭焱 路英丽 左文静 王忠山 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1441-1444,共4页

目的在毕赤酵母细胞中表达PSA,为临床的检测和治疗提供材料。方法经RT-PCR获得PSA全长cDNA并测序。将编码成熟PSA237氨基酸的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,该载体含有AOX1启动子和α-factor信号肽序列,构建表达载体体pPICZαC... 目的在毕赤酵母细胞中表达PSA,为临床的检测和治疗提供材料。方法经RT-PCR获得PSA全长cDNA并测序。将编码成熟PSA237氨基酸的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,该载体含有AOX1启动子和α-factor信号肽序列,构建表达载体体pPICZαC-mPSA。甲醇诱导X33细胞表达rPSA,ELASA试剂盒筛选高表达rPSA的细胞株。结果获得了人PSA全长序列,构建了表达载体pPICZα-mPSA。获得了高表达rPSA的酵母X33细胞株,表达产量为1.2mg/L。结论建立了重组人前列腺特异性抗原的毕赤酵母表达体系,规模化的生产有助于PSA的生物学特性的研究和临床检测和治疗的应用. 展开更多

关键词 前列腺特异性抗原 毕赤酵母

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SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

13

作者 汤巧 钱超 +1 位作者 夏永祥 卢春 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2005年第5期377-379,383,共4页

目的:构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法: 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-S.重组质粒经酶切鉴定... 目的:构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法: 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果: 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论: SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达. 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 S蛋白 真核表达 毕赤酵母

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凋亡抑制因子Survivin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达 被引量：1

14

作者 王跃华 张青云 《肿瘤研究与临床》 CAS 2005年第5期305-308,共4页

目的克隆凋亡抑制因子Survivin基因,利用甲醇酵母Pichiapastoris真核表达系统表达Survivin蛋白。方法利用Survivin特异引物,通过PCR方法扩增人Survivin基因后进行测序,将序列正确的Survivin基因与分泌表达载体pPic9k重组,重组体酶切线... 目的克隆凋亡抑制因子Survivin基因,利用甲醇酵母Pichiapastoris真核表达系统表达Survivin蛋白。方法利用Survivin特异引物,通过PCR方法扩增人Survivin基因后进行测序,将序列正确的Survivin基因与分泌表达载体pPic9k重组,重组体酶切线性化后用电穿孔法转入酵母宿主菌GS115/His-中,以不同浓度G418/YPD平板筛选,经PCR扩增鉴定阳性克隆,再用含1%甲醇的培养基BMMY诱导表达蛋白,ELISA法检测表达产物。结果克隆的人Survivin基因与GenBank中的Survivin基因序列完全一致,无突变;构建了真核表达载体pPic9k-Survivin,并转入酵母菌GS115/His-后,筛选出了抗高浓度(4mg/mL)G418的阳性克隆(GS115/His+)6个,并用PCR法进行了鉴定;Survivin的表达量与时间有关,48h的表达量最高。结论用Pichiapastoris真核表达系统表达Survivin蛋白的方法可行,若进一步优化条件,可大量表达Survivin蛋白,为进一步研究Survivin的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用提供了重要的实验基础。 展开更多

关键词 SURVIVIN 凋亡抑制 PICHIA pastoris表达 肿瘤

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