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融合大肠杆菌素DNA结合域的Taq DNA聚合酶的性质表征 被引量：1
1
作者 王亚平 平啸寅 +3 位作者 赵艺 刘阳 吴林 马立新 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期812-820,共9页
Taq DNA聚合酶发现自水生热栖菌(Thermus aquaticus),是一种同时具有逆转录酶活性以及DNA聚合酶活性的工具酶。Colicin E(简称CE)蛋白质是一类以维生素受体BtuB为跨膜受体的大肠杆菌素,其中CE2、CE7、CE8和CE9是非特异性的DNase型大肠... Taq DNA聚合酶发现自水生热栖菌(Thermus aquaticus),是一种同时具有逆转录酶活性以及DNA聚合酶活性的工具酶。Colicin E(简称CE)蛋白质是一类以维生素受体BtuB为跨膜受体的大肠杆菌素,其中CE2、CE7、CE8和CE9是非特异性的DNase型大肠杆菌素。Taq DNA聚合酶由5′→3′核酸外切酶结构域、3′→5′核酸外切酶结构域以及聚合酶结构域组成。缺失5′→3′核酸外切酶结构域的Taq DNA聚合酶(ΔTaq)具有更高的产量,但是其进行性很低,无法扩增长片段。为了提高ΔTaq的进行性,本研究融合dCE和ΔTaq,发现dCE-ΔTaq的进行性相比于Taq DNA聚合酶和dCE-Taq显著提升,并且其逆转录酶活性也比ΔTaq更高。dCE8-ΔTaq的提升最明显,不仅能够1 min内扩增8 kb的DNA片段,并且产量高于其他突变体。综上所述,本研究通过将ΔTaq DNA聚合酶和dCE进行融合,提升了Taq DNA聚合酶的PCR效率和逆转录活性,为改造Taq DNA聚合酶提供了新的方法,有望开发出性质更好的Taq DNA聚合酶。 展开更多
关键词 Taq DNA聚合酶 CE pcr效率 逆转录活性
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新型冠状病毒核酸检测试剂盒中酶的性能比较研究 被引量：3
2
作者 杨镇州 李妍 +2 位作者 杨雪 刘刚 梁文 《生物技术进展》 2021年第6期777-782,共6页
新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS⁃CoV⁃2)核酸检测试剂盒中酶的性能对检测效果有决定性作用。为探索逆转录酶和DNA聚合酶性能的快速评价方法,采用常用SARS⁃CoV⁃2核酸检测试剂盒,以SARS⁃CoV⁃2核酸标... 新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS⁃CoV⁃2)核酸检测试剂盒中酶的性能对检测效果有决定性作用。为探索逆转录酶和DNA聚合酶性能的快速评价方法,采用常用SARS⁃CoV⁃2核酸检测试剂盒,以SARS⁃CoV⁃2核酸标准物质为考察依据,对试剂盒中逆转录酶、DNA聚合酶的技术性能进行综合评价研究。第一步,通过分析cDNA产物与目标RNA浓度比值,考察逆转录酶的逆转录效率;第二步,以相同的cDNA为目标样品,进行实时荧光定量PCR分析;第三步,以新冠病毒RNA标准物质为目标样品,进行逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT⁃PCR),比较试剂盒的扩增效率;第四步,考察试剂盒中酶的热稳定性。结果显示,所考察的试剂盒产品逆转录酶的逆转录效率为6.5%~80.7%,DNA聚合酶的扩增效率为90.4%~119.7%,而总体逆转录PCR的扩增效率为90.7%~102.4%。热稳定性评价结果显示,初始较好的酶活性可能在保存和运输期间发生质量变化。通过反映目前新冠病毒核酸检测试剂盒中酶的质量水平,以期对相关质控工作提供一定参考。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 RT⁃pcr 逆转录 pcr效率
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转基因水稻标准质粒分子的构建与分析 被引量：2
3
作者 刘晋 邓汉超 +5 位作者 王学林 侯红利 李永红 杨启鹏 陈惠芳 周向阳 《中国种业》 2016年第12期52-55,共4页
针对目前转基因（GM）产品检测标准分子的缺乏，构建适用于转基因水稻的标准质粒分子pMDSPS和pMDTheli，其中包含水稻内源基因腓通用序列，耐盐基因ThST3和Ubiquitin启动子序列的构建特异性Theli序列。对其特异性及制备标准曲线的可靠... 针对目前转基因（GM）产品检测标准分子的缺乏，构建适用于转基因水稻的标准质粒分子pMDSPS和pMDTheli，其中包含水稻内源基因腓通用序列，耐盐基因ThST3和Ubiquitin启动子序列的构建特异性Theli序列。对其特异性及制备标准曲线的可靠性进行鉴定研究，研究结果显示，在进行普通PCR扩增时，采用质粒标准分子为阳性对照，均能特异扩增目的条带。以标准质粒分子构建的标准曲线，sPs基因的定量标准曲线的相关系数平均为0．9993，PCR扩增效率在1．0004～1．034之间；ThST3基因的定量标准曲线的相关系数平均为0．9937，PCR扩增效率在0．9358～0．9486之间。因此，构建的标准分子pMDSPS和pMDTheli既能作为普通PCR的阳性对照，也能用于定量标准曲线的构建，为转基因水稻的定量检测提供简便、价格低廉的标准分子打下基础。 展开更多
关键词 标准质粒分子 实时荧光pcr 标准曲线 pcr效率
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二甲基亚砜和5-氮胞苷诱导P19细胞转化为心肌细胞的效率
4
作者 金鹏 申星花 李学奇 《中国老年学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期975-977,共3页
目的分析二甲基亚砜(DMSO)和5-氮胞苷(5-Aza)诱导P19细胞转化为心肌细胞的效率,比较两者的区别。方法将研究对象分为3组。一组使用常规方法对P19细胞进行培养,为阴性对照组;一组使用DMSO 1.0%进行诱导;一组使用5-Aza 10μmol/L进行诱导... 目的分析二甲基亚砜(DMSO)和5-氮胞苷(5-Aza)诱导P19细胞转化为心肌细胞的效率,比较两者的区别。方法将研究对象分为3组。一组使用常规方法对P19细胞进行培养,为阴性对照组;一组使用DMSO 1.0%进行诱导;一组使用5-Aza 10μmol/L进行诱导。对所有研究对象使用RT-PCR法检测GATA-4基因相对表达量。结果 DMSO和5-Aza组诱导4 d后,细胞均以克隆集落方式增殖,梭形细胞明显增多。8 d出现自发性节律收缩的心肌样细胞。诱导后2 w,5-Aza组分化细胞明显多于DMSO组。RT-PCR法检测GATA-4基因相对表达量,除阴性对照组外,其他两组均表达心肌早期分化基因。每组15 d后表达量与本组7 d表达量相比较均明显增加。此外,5-Aza组诱导28 d基因表达量明显高于DMSO组28 d。结论 DMSO 1.0%和5-Aza 10μmol/L均可诱导P19细胞转化为心肌细胞,5-Aza 10μmol/L的诱导效率高于DMSO 1.0%。 展开更多
关键词 P19细胞 DMSO诱导 5-Aza诱导 RT-pcr效率
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自组装短肽K_2I_4K_2在PCR中提高Taq DNA聚合酶热稳定性 被引量：1
5
作者 李萌萌 徐晓帆 +2 位作者 陈振银 张慧楠 罗忠礼 《基础医学与临床》 CSCD 2016年第7期879-885,共7页
目的设计自组装短肽K_2I_4K_2作为新型表面活性剂来稳定Taq DNA聚合酶,探索其对Taq DNA聚合酶在高温下的半衰期以及对PCR扩增效率的影响,探讨其在PCR中应用的可行性。方法圆二色仪检测短肽K_2I_4K_2在不同理化条件下的二级结构;原子力... 目的设计自组装短肽K_2I_4K_2作为新型表面活性剂来稳定Taq DNA聚合酶,探索其对Taq DNA聚合酶在高温下的半衰期以及对PCR扩增效率的影响,探讨其在PCR中应用的可行性。方法圆二色仪检测短肽K_2I_4K_2在不同理化条件下的二级结构;原子力显微镜检测其自组装形成的纳米结构特征;紫外可见光谱检测其对Taq酶在高温下半衰期的影响;普通PCR验证其在PCR中应用的可行性;RT-q PCR检测其对Taq酶扩增效率的影响。结果短肽K_2I_4K_2在盐离子溶液中能自组装形成纳米纤维结构,且在高温下拥有稳定的二级结构;短肽K_2I_4K_2使得Taq在95℃下的半衰期增加了约1.6倍;短肽K_2I_4K_2组装24 h后大大增加了Taq酶的扩增效率。结论短肽K_2I_4K_2较为显著地增加了Taq DNA聚合酶的热稳定性,能够很好地应用于PCR反应系统中。 展开更多
关键词 自组装短肽 纳米纤 Taq酶半衰期 pcr扩增效率
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硫化叶菌病毒dUTPase基因的表达及酶学活性分析
6
作者 朱国东 魏云林 +2 位作者 张琦 季秀玲 林连兵 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期712-716,共5页
对硫化叶菌病毒(Sulfolobus virus)STSV2脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)基因进行克隆表达,并分析其酶学特征.根据STSV2的dUTPase基因序列设计特异性引物,以病毒STSV2 DNA为模板进行PCR扩增,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,然后,将其... 对硫化叶菌病毒(Sulfolobus virus)STSV2脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)基因进行克隆表达,并分析其酶学特征.根据STSV2的dUTPase基因序列设计特异性引物,以病毒STSV2 DNA为模板进行PCR扩增,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,然后,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)进行dUTPase的IPTG诱导表达及纯化,通过SDS-PAGE检测其大小,并测定其酶学活性.结果表明,诱导表达的重组dUTPase蛋白分子量(Mr)约为38×103(含pET32a(+)自带的助溶标签),重组dUTPase在Mg2+存在的情况下能特异性催化dUTP生成dUMP和PPi,其反应最适温度为60℃,在pH值3-8之间有较高的活性,其在提高PCR扩增效率和特异性方面具有一定的作用.本研究通过克隆表达获得了硫化叶菌病毒(Sulfolobus virus)STSV2脱氧尿苷焦磷酸酶,其在基因扩增领域有一定的应用价值. 展开更多
关键词 硫化叶菌病毒 脱氧尿苷焦磷酸酶 pcr扩增效率 原核表达 酶学活性
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