目的构建Flag-葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)与转座酶Tn5基因的重组原核表达质粒p TXB1-Flag-pA-Tn5,在大肠埃希菌中表达、纯化重组Flag-pA-Tn5蛋白,并检测其转座酶活性。方法合成Flag-pA基因的DNA编码序列,PCR扩增后插...目的构建Flag-葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)与转座酶Tn5基因的重组原核表达质粒p TXB1-Flag-pA-Tn5,在大肠埃希菌中表达、纯化重组Flag-pA-Tn5蛋白,并检测其转座酶活性。方法合成Flag-pA基因的DNA编码序列,PCR扩增后插入原核表达载体pTXB1-Tn5,构建重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5;转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达带有Flag标签的pA-Tn5蛋白,并经几丁质树脂亲和纯化后透析复性;将Flag-p A-Tn5蛋白与含测序引物接头的转座子DNA片段组装成转座体,取不同稀释比例的转座体与人外周血白细胞基因组DNA共孵育,以DNA孵育产物为模板、测序引物进行PCR扩增,鉴定Flag-pA-Tn5转座酶活性。结果重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组蛋白产量为211.1μg/mL,能够被几丁质树脂亲和纯化,纯度为84%;Flag-pA-Tn5蛋白与转座子DNA片段组装后,能有效切割人外周血白细胞基因组DNA,并连接测序引物接头,具有转座酶活性。结论获得了具有转座酶活性的重组Flag-pA-Tn5蛋白,为进一步利用Flag-p A-Tn5转座酶进行基因功能组学研究奠定了基础。展开更多
