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尿黑酸双加氧酶基因工程菌的构建
1
作者 肖路梅 杨江科 +2 位作者 晁群芳 彭小波 马腾飞 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期2627-2634,共8页
为了构建不同表达类型的尿黑酸双加氧酶(Dio6)基因工程菌,本研究利用Over-lap PCR技术使双加氧酶基因在组成型启动子(P2和PspoⅠ-Ⅱ)的控制下表达;利用高效液相色谱(HPLC)技术测定XJ-6、XJ-6+PT7、XJ-6+P2、XJ-6+PspoⅠ-Ⅱ、PspoⅠ-Ⅱ... 为了构建不同表达类型的尿黑酸双加氧酶(Dio6)基因工程菌,本研究利用Over-lap PCR技术使双加氧酶基因在组成型启动子(P2和PspoⅠ-Ⅱ)的控制下表达;利用高效液相色谱(HPLC)技术测定XJ-6、XJ-6+PT7、XJ-6+P2、XJ-6+PspoⅠ-Ⅱ、PspoⅠ-Ⅱ、P2、PT7在7 d对芘的降解。研究结果表明:构建得到3种启动子控制表达的基因工程菌,协同效应研究表明工程菌在XJ-6的协助下可以在含芘的无机盐培养基中生长,并且组成型启动子工程菌的菌数远高于诱导型启动子工程菌的菌数。组成型启动子相较于诱导型启动子工程菌能更稳定表达外源双加氧酶基因,由于诱导型启动子工程菌需要诱导剂IPTG,并且表达双加氧酶基因会受到诱导剂浓度、诱导温度等条件的影响,所以在实际应用中组成型启动子工程菌优于诱导型启动子工程菌。 展开更多
关键词 基因工程菌 组成型启动子 over-lap pcr 协同效应 HPLC
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序列特异的三锌指多肽的构建及其在大肠杆菌中的表达 被引量：1
2
作者 张书祥 马清钧 赵志虎 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期406-409,共4页
在获得单一锌指突变体的基础上 ,以小鼠转录因子Zif2 6 8的三锌指DNA结合区为模板 ,利用重叠 (Over lap)PCR技术 ,获得了关键氨基酸位点同时突变的三锌指突变体ZF12 3、2ZF12 3。ZF12 3、2ZF12 3分别克隆进pUC 18质粒 ,序列测定正确后 ,... 在获得单一锌指突变体的基础上 ,以小鼠转录因子Zif2 6 8的三锌指DNA结合区为模板 ,利用重叠 (Over lap)PCR技术 ,获得了关键氨基酸位点同时突变的三锌指突变体ZF12 3、2ZF12 3。ZF12 3、2ZF12 3分别克隆进pUC 18质粒 ,序列测定正确后 ,以pGEX 2T为表达质粒 ,在大肠杆菌JM10 9中实现了功能性的表达。经SDS PAGE分析 ,表达出了分子量 34 0kD的融合蛋白 ,扫描分析其含量在 2 0 %左右。菌体经超声波破碎后 ,对可溶性融合蛋白进行了纯化得到了游离的目的蛋白 ,为进一步的DNA结合特性分析、杂交转录因子的构建等奠定了基础。 展开更多
关键词 锌指蛋白 重桑pcr 表达 纯化 大肠杆菌
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重叠PCR技术在构建sodAP基因表达载体中的应用 被引量：1
3
作者 叶艳华 何冰芳 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第9期762-764,共3页
目的应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表... 目的应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pET-22b(+),构建重组质粒pET-PsodAP,转化E.coliBL21(DE3)进行表达。用SDS-PAGE检测表达产物,光密度定量分析法分析目的蛋白表达量。结果启动子P121和sodAP基因的连接产物经凝胶电泳检测,可见约800bp的目的条带,测序结果与预期相符;重组表达质粒pET-PsodAP经双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得了表达,表达量占菌体总蛋白的19%。结论应用重叠PCR技术,成功构建了sodAP基因的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中获得表达,为Mn-SOD的进一步工业化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 重叠pcr 节杆菌DMDC12 sodAP基因 表达载体
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调控民猪ZBED6基因转录元件的筛选与分析 被引量：1
4
作者 张冬杰 刘洋 +2 位作者 汪亮 李忠秋 刘娣 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2019年第7期76-81,共6页
ZBED6是锌指蛋白家族的一员,在胎盘哺乳动物中极其保守,可通过对IGF2的调控参与骨骼肌生长。为进一步探究ZBED6基因自身的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过常规PCR扩增ZBED6基因启动子区系列截短片段,构建克隆质粒,通过... ZBED6是锌指蛋白家族的一员,在胎盘哺乳动物中极其保守,可通过对IGF2的调控参与骨骼肌生长。为进一步探究ZBED6基因自身的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过常规PCR扩增ZBED6基因启动子区系列截短片段,构建克隆质粒,通过双酶切和连接反应定向连入pGL3-basic载体,利用PK15细胞和双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;利用在线软件预测启动子区的转录因子结合位点,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点,构建突变载体并在PK15细胞中检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明:ZBED6基因启动子区-2053^-1777 bp存在多个转录因子结合位点,尤其是-1808^-1777 bp,该片段缺失造成启动子活性下降(P<0.01);利用在线软件在该区间预测到3个转录因子HINFP、Adf-1和CREB3,经实验验证后发现这3个转录因子均可调控ZBED6基因的转录,其中Adf-1效果最为明显。据此推测,民猪ZBED6基因的转录调控机制较为复杂,其启动子区存在HINFP、Adf-1和CREB3等多个调控元件的结合位点。 展开更多
关键词 ZBED6基因 启动子 荧光素酶活性 重叠pcr 民猪
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小分子RNA表达载体构建的新方法--MicroRNA前体PCR置换法 被引量：2
5
作者 陈锐 胡正 张辉 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期101-105,共5页
MicroRNA(miRNA)基因的终产物是进化上高度保守的、具有基因表达调控功能的非编码小分子RNA。miRNA的特征性发卡环前体(pre-miRNAs)在体内经数步加工后,与AGO蛋白构成沉默复合体(RISC)以行使其功能。如将已知pre-miRNAs上的miRNA成熟链... MicroRNA(miRNA)基因的终产物是进化上高度保守的、具有基因表达调控功能的非编码小分子RNA。miRNA的特征性发卡环前体(pre-miRNAs)在体内经数步加工后,与AGO蛋白构成沉默复合体(RISC)以行使其功能。如将已知pre-miRNAs上的miRNA成熟链和互补链(miRNA*)分别置换为有待研究的小分子RNA,并构建表达载体转化植株,利用转化株内源的miRNA成熟加工体系,可以产生预设的小分子RNA。利用已知拟南芥miRNA前体为模板,使用替换PCR的方法,人工构建了gso8-ap-miRNA-pBI121表达载体。利用农杆菌介导法转化拟南芥,多数T1代植株表现出提早开花的突变表型。该方法是一种简便、高效的构建小分子RNA表达载体的方法。 展开更多
关键词 小分子RNA MICRORNA pcr置换法
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Zif268基因突变体的克隆与真核表达载体的构建
6
作者 张书祥 赵志虎 《生物学杂志》 CAS CSCD 2003年第2期17-18,22,共3页
以小鼠转录因子Zif2 68的三锌指DNA结合区为模板 ,利用重叠 (Overlap)PCR技术 ,获得Zif2 68关键氨基酸位点同时突变的三锌指突变体ZF1 2 3、2ZF1 2 3。以ZF1 2 3、2ZF1 2 3为模板 ,PCR扩增获得TAT -ZF1 2 3 ,TAT- 2ZF1 2 3序列。构建表... 以小鼠转录因子Zif2 68的三锌指DNA结合区为模板 ,利用重叠 (Overlap)PCR技术 ,获得Zif2 68关键氨基酸位点同时突变的三锌指突变体ZF1 2 3、2ZF1 2 3。以ZF1 2 3、2ZF1 2 3为模板 ,PCR扩增获得TAT -ZF1 2 3 ,TAT- 2ZF1 2 3序列。构建表达质粒pET- 2 8-a+ -TAT-ZF1 2 3 ,pET - 2 8-a+ -TAT - 2ZF1 2 3。为利用HIVTAT蛋白的跨膜功能 ,实现ZF1 2 3、2ZF1 2 展开更多
关键词 锌指蛋白 重叠pcr TAT蛋白 Zif268基因突变体 基因克隆 真核表达载体
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大仓鼠β_2肾上腺素受体基因的套叠PCR法多点突变研究 被引量：5
7
作者 王迪 黄园园 +2 位作者 杨曙明 于洪峡 杨啸枫 《生命科学研究》 CAS CSCD 2008年第1期45-49,共5页
对大仓鼠β2肾上腺素受体蛋白(β2 adrenergic receptor,β2AR)进行立体结构与疏水性分析.利用套叠PCR法对β2AR基因进行多点突变,将保守跨膜域疏水氨基酸突变为正电荷亲水氨基酸,成功构建分别带有7个与3个突变氨基酸的原核突变表达载体... 对大仓鼠β2肾上腺素受体蛋白(β2 adrenergic receptor,β2AR)进行立体结构与疏水性分析.利用套叠PCR法对β2AR基因进行多点突变,将保守跨膜域疏水氨基酸突变为正电荷亲水氨基酸,成功构建分别带有7个与3个突变氨基酸的原核突变表达载体.探讨了套叠PCR的反应条件,为β2AR基因在体外的高量表达提供基础. 展开更多
关键词 β2肾上腺素受体基因 G蛋白偶联受体 套叠pcr 突变
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大肠杆菌碱性磷酸酶突变体的构建及其结构与功能研究 被引量：2
8
作者 王秋颖 李宁 向本琼 《北京师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期647-652,共6页
以大肠杆菌碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）高活性突变株（L138PG233S）为亲本,采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变,成功获得了氨基酸替换突变体3个,并对它们的酶活性、特性、内源荧光发射峰等与亲本酶进行了比较分析.结果发现... 以大肠杆菌碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）高活性突变株（L138PG233S）为亲本,采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变,成功获得了氨基酸替换突变体3个,并对它们的酶活性、特性、内源荧光发射峰等与亲本酶进行了比较分析.结果发现：与亲本酶相比,突变体酶的酶活性降低了18%-85%,Vmax值降低,Km增加,内源荧光发射峰λmax增大等.与亲本酶相同,Zn^2＋,Mn^2＋,Mg^2＋仍是它们的激活剂,Na3PO4是它们的抑制剂;这些实验结果说明突变体酶活性的降低直接与其构象变化有关,被替换的氨基酸在维持碱性磷酸酶的结构和功能方面具有特定的作用. 展开更多
关键词 大肠杆菌碱性磷酸酶 重叠延伸pcr 突变体 特性分析 荧光光谱
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Kir2.1/Kir2.3嵌合体的构建与表达 被引量：1
9
作者 赵志英 朱宏谦 +2 位作者 张璇 刘丽 张国红 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期733-736,共4页
目的构建Kir2.1/Kir2.3通道嵌合体,为进一步研究Kir2.1和Kir2.3通道的调控机制打下基础。方法利用重叠延伸PCR方法构建不同的Kir2.1/Kir2.3嵌合体质粒:N1P3C3,N3P1C1,N3P3C1,N1P1C3,NIP3C1,N3P1C3。将不同的嵌合体质粒分别用NheI线性化... 目的构建Kir2.1/Kir2.3通道嵌合体,为进一步研究Kir2.1和Kir2.3通道的调控机制打下基础。方法利用重叠延伸PCR方法构建不同的Kir2.1/Kir2.3嵌合体质粒:N1P3C3,N3P1C1,N3P3C1,N1P1C3,NIP3C1,N3P1C3。将不同的嵌合体质粒分别用NheI线性化后,转录为cRNA表达于非洲爪蟾卵母细胞,用双电极电压钳记录电流。结果不同的Kir2.1/Kir2.3嵌合体质粒构建成功,在非洲爪蟾卵母细胞上可以记录到电流表达。结论成功构建Kir2.1/Kir2.3嵌合体并完成了嵌合体通道的异源性表达和电压钳记录。 展开更多
关键词 Kir2 3 Kir2 1 钾通道 嵌合体 重叠延伸pcr 双电极电压钳 非洲爪蟾卵母细胞
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