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布鲁氏菌外膜蛋白Omp16的原核表达、纯化及多克隆抗体制备 被引量：7
1
作者 熊流新 黄健 +6 位作者 张涛 李晓婷 徐梅 陈昱希 陈安林 胡永林 闵迅 《现代医药卫生》 2018年第5期669-673,共5页
目的克隆、表达、纯化布鲁氏菌Omp16重组蛋白,并制备多克隆抗体,评估其作为布鲁氏菌蛋白质疫苗的可行性。方法 PCR法扩增全长及截短的布鲁氏菌Omp16基因,并将其克隆入p ET28a(+)载体中;经菌液PCR和测序鉴定后,再转入大肠杆菌BL21(DE3)中... 目的克隆、表达、纯化布鲁氏菌Omp16重组蛋白,并制备多克隆抗体,评估其作为布鲁氏菌蛋白质疫苗的可行性。方法 PCR法扩增全长及截短的布鲁氏菌Omp16基因,并将其克隆入p ET28a(+)载体中;经菌液PCR和测序鉴定后,再转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达及镍柱纯化后,获取高纯度的Omp16目的蛋白,然后将其免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体,Western blotting检测抗体的特异性免疫反应。结果成功构建了全长及截短表达的Omp16原核表达质粒,经IPTG诱导表达后,获得了全长及截短Omp16蛋白,免疫BALB/c小鼠后获得了高效价的抗Omp16多克隆抗体。Western blotting实验证实2种Omp16重组蛋白(Omp16-1、Omp16-2)均能与其相应抗体发生特异性免疫反应。结论该研究成功克隆、表达、纯化了全长及截短的Omp16重组蛋白,2种Omp16重组蛋白均具有很好的免疫原性,且能与高滴度的小鼠多克隆抗体发生特异性结合,为后续以Omp16蛋白为基础的疫苗研发奠定了实验基础。 展开更多
关键词 布鲁菌属 基因表达 omp16 蛋白纯化
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布鲁氏菌OMP16抗体的间接ELISA方法建立 被引量：5
2
作者 田路路 李会玲 +4 位作者 支飞杰 王小雨 翟云逸 靳亚平 王爱华 《动物医学进展》 北大核心 2021年第3期30-35,共6页
为建立羊血清布鲁氏菌抗体的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)方法,以布鲁氏菌(B.suis) S2疫苗株的基因组为模板,通过引物设计、PCR扩增、原核载体构建、IPTG诱导,NTA树脂层析柱亲和层析法纯化重组布鲁氏菌外模蛋白16(OMP16),通过SDS-PAGE... 为建立羊血清布鲁氏菌抗体的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)方法,以布鲁氏菌(B.suis) S2疫苗株的基因组为模板,通过引物设计、PCR扩增、原核载体构建、IPTG诱导,NTA树脂层析柱亲和层析法纯化重组布鲁氏菌外模蛋白16(OMP16),通过SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,以纯化的OMP16作为包被抗原,优化反应条件,建立检测布鲁氏菌抗体的iELISA方法。结果显示,克隆了Omp16基因,表达、纯化了重组蛋白OMP16,该重组蛋白具有很好的反应原性。iELISA检测方法的最佳反应条件为:抗原包被浓度1μg/mL,血清稀释倍数为10倍,酶标二抗的稀释度为1:1 000,TMB的反应时间为30 min。临床样本检测显示,建立的iELISA方法具有良好的灵敏度,与虎红平板凝集试验的符合率达到了93%。本研究建立的iELISA方法能够满足生产实践中布鲁氏菌病的检测,为布鲁氏菌病流行病学调查提供了技术支持。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外模蛋白16 蛋白纯化 间接酶联免疫吸附试验
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基于外膜蛋白Omp16的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA方法的建立 被引量：4
3
作者 郑新添 李晓华 +3 位作者 胡晓丹 许君茹 林炜明 杨小燕 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期607-610,638,共5页
为建立检测副猪嗜血杆菌(H.parasuis)抗体方法,本研究以H.parasuis外膜蛋白Omp16为包被抗原建立了检测H.parasuis的间接ELISA方法。反应条件经优化为:抗原包被浓度为1μg/m L,血清稀释度为1:80;血清与抗原最佳作用时间为40 min,二抗稀释... 为建立检测副猪嗜血杆菌(H.parasuis)抗体方法,本研究以H.parasuis外膜蛋白Omp16为包被抗原建立了检测H.parasuis的间接ELISA方法。反应条件经优化为:抗原包被浓度为1μg/m L,血清稀释度为1:80;血清与抗原最佳作用时间为40 min,二抗稀释10 000倍,与一抗孵育30 min;TMB作用时间为30 min。利用该ELISA方法检测H.parasuis、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌和猪链球菌2型等血清,除H.parasuis为阳性外其余均为阴性,表明其特异性强。该ELISA方法可检测到最高稀释度为1∶512的阳性血清,敏感性高。重复性试验显示,其批内和批间的重复试验变异系数(CV)分别在3.62%~8.97%和4.3%~9.50%。该ELISA检测方法与进口ELISA试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和总体符合率分别为87.8%,90.7%和88.6%。本研究建立的间接ELISA方法,为H.parasuis血清流行病学调查及疫苗免疫评价等提供了重要手段。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 间接ELISA omp16 诊断
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布鲁氏菌OMP16对RAW264.7细胞凋亡与免疫活性的影响 被引量：1
4
作者 李杨 周栋 +7 位作者 尹彦龙 张广冻 相彩霞 支飞杰 白芙蓉 林鹏飞 靳亚平 王爱华 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期2642-2651,共10页
旨在研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP16对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡和免疫活性的影响及其机制探讨。以OMP16处理RAW264.7细胞为模型,通过MTT以及Hoechst法检测OMP16对细胞活力的影响,通过Western blot检测Caspase-3、GRP78、CHOP的表达情况... 旨在研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP16对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡和免疫活性的影响及其机制探讨。以OMP16处理RAW264.7细胞为模型,通过MTT以及Hoechst法检测OMP16对细胞活力的影响,通过Western blot检测Caspase-3、GRP78、CHOP的表达情况,流式细胞术检测OMP16对细胞凋亡的影响以及RTPCR检测免疫因子IL-1β、IL-6和TNF-α的变化。结果表明,OMP16能够影响RAW264.7细胞的活力,且有浓度依赖性;添加OMP16后能够显著增加凋亡标志因子Caspase-3的表达(P<0.001),并促进RAW264.7细胞的凋亡;作用24、36h之后,显著引起内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP的表达;并且能显著上调IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的mRNA表达水平。布鲁氏菌OMP16能够诱导RAW264.7凋亡,OMP16显著引起内质网应激CHOP通路的激活。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外膜蛋白 omp16 RAW264.7 细胞凋亡 免疫活性
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布鲁菌外膜蛋白16纯化方法的改进
5
作者 杨磊 张建坡 +3 位作者 王相国 许勤 靳亚平 王爱华 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第12期25-28,共4页
为了获得布鲁菌外膜蛋白16(Omp16),通过PCR技术扩增到Omp16基因片段,将其连接到pET32a载体,转化大肠埃希菌BL21,诱导其表达,应用改进的纯化方法,进行HIS-镍蛋白纯化柱纯化。结果表明,改进后的纯化方法增加了布鲁菌Omp16的可溶性,提高了... 为了获得布鲁菌外膜蛋白16(Omp16),通过PCR技术扩增到Omp16基因片段,将其连接到pET32a载体,转化大肠埃希菌BL21,诱导其表达,应用改进的纯化方法,进行HIS-镍蛋白纯化柱纯化。结果表明,改进后的纯化方法增加了布鲁菌Omp16的可溶性,提高了蛋白纯化效率和纯度。试验确定的纯化程序可有效获得高纯度的Omp16,对其他重组蛋白的高效纯化具有借鉴意义。 展开更多
关键词 布鲁菌 外膜蛋白16 原核表达 纯化
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羊种布鲁氏菌OMP16蛋白结构的生物信息学分析 被引量：13
6
作者 李智伟 张峰波 +5 位作者 卢佩佩 贾斌 周延 刘小双 岳晓媚 丁剑冰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期21-27,33,共8页
目的使用生物信息学方法预测羊布鲁氏菌OMP16蛋白的结构特点,并预测可能的B细胞和T细胞优势表位。方法从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的OMP16蛋白的氨基酸序列。通过ProtParam分析OMP16蛋白的理化性质;利用DNAstar和SOMPA分析OMP16蛋白... 目的使用生物信息学方法预测羊布鲁氏菌OMP16蛋白的结构特点,并预测可能的B细胞和T细胞优势表位。方法从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的OMP16蛋白的氨基酸序列。通过ProtParam分析OMP16蛋白的理化性质;利用DNAstar和SOMPA分析OMP16蛋白二级结构;利用Phyre2和Rasmol构建并分析OMP16蛋白三级结构;利用IEDB、DNAStar、ABCpred和BepiPred预测OMP16蛋白的B细胞抗原表位;利用SYFPEITHI和IEDB预测OMP16蛋白的T细胞抗原表位。结果 OMP16蛋白有426个氨基酸序列,理论等电点为9.72,原子组成为C2026H3209N499O536S17,为稳定性疏水性蛋白。二级结构显示α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别是40.61%,19.01%,8.45%和31.92%。预测出4个B细胞优势表位,分别是93-102,183-187,273-289,294-301;5个CTL细胞优势表位,分别是69-77,175-183,267-275,373-381,408-416;5个Th细胞优势表位,分别是4-20,32-46,63-77,316-330,352-366。结论羊布鲁氏菌OMP16蛋白结构中有4个B细胞优势表位,5个CTL细胞优势表位和5个Th细胞优势表位,为进一步为布鲁氏菌诊断和疫苗研究的奠定基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 omp16蛋白 生物信息学 B细胞表位 T细胞表位
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布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定 被引量：1
7
作者 李俊萱 吴胜昔 +6 位作者 曾政 李令臣 鲁友铭 侯力嘉 李志 徐缘 李红 《重庆理工大学学报（自然科学）》 CAS 北大核心 2019年第2期162-166,215,共6页
为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体... 为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 omp16蛋白 原核表达 镍柱纯化 蛋白免疫印迹
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