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Tip30调节EGFR核内化及其与核内EGFR靶分子或基因的关联性研究 被引量：2
1
作者 陈锦章 李祺 +1 位作者 邓琼 李爱民 《中国临床研究》 CAS 2015年第1期7-10,共4页
目的探讨肿瘤转移抑制基因(Tip30)调节表皮生长因子受体(EGFR)核内化及与核内化EGFR靶分子或基因的关联性,为针对EGFR分子靶向治疗提供依据。方法采用野生型Balb/c小鼠(Tip30+/+小鼠,对照组)和Tip30基因敲除、Balb/c纯背景的小鼠(Tip30... 目的探讨肿瘤转移抑制基因(Tip30)调节表皮生长因子受体(EGFR)核内化及与核内化EGFR靶分子或基因的关联性,为针对EGFR分子靶向治疗提供依据。方法采用野生型Balb/c小鼠(Tip30+/+小鼠,对照组)和Tip30基因敲除、Balb/c纯背景的小鼠(Tip30-/-小鼠)作为动物模型(每组6只),饲养18个月后处死,取肺组织,福尔马林固定,酒精脱水,石蜡包埋,组织切片后,进行组织学检查、免疫组化检测、组织免疫荧光检测、体外培养细胞免疫荧光/激光共聚焦检测、免疫印迹检测、细胞计数试剂盒-8方法体外细胞抑制实验、荧光定量PCR检测和基因芯片数据库分析。结果 Tip30基因敲除促进肺上皮细胞增殖、上调细胞周期蛋白cyclin D1表达;基因转染后Tip30-SH1、Tip30-SH2细胞抑制Tip30表达;Tip基因抑制致EGFR在早期内涵体滞留;表皮生长因子(EGF)处理可诱导Tip30细胞核内化;Tip30基因抑制可促进EGF诱导EGFR细胞核内化,Tip30蛋白可在早期内涵体内聚集。结论 Tip30基因抑制干扰EGFR分选,抑制EGF诱导EGFR降解,延迟EGFR下游信号分子激活时间,同时促进EGF诱导的EGFR细胞核内化,促进肺癌细胞生长,而与细胞膜或细胞浆内EGFR信号通路激活的关联性较小。 展开更多
关键词 肺癌 TIP30基因 表皮生长因子受体 表皮生长因子受体核内化 核内化
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CysLT_(1)R对APP-HEK293细胞Aβ生成的调控作用及其机制
2
作者 龙燕 柯璇 洪浩 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1666-1674,共9页
目的探究CysLT_(1)R对APP-HEK293细胞中Aβ生成的影响并探寻其可能的作用机制。方法构建慢病毒载体LV-CysLT_(1)R-EGFP并转染APP-HEK293细胞,激动剂YM17690单独处理或拮抗剂普仑司特和YM17690共同处理细胞,采用ELISA检测Aβ;Western blo... 目的探究CysLT_(1)R对APP-HEK293细胞中Aβ生成的影响并探寻其可能的作用机制。方法构建慢病毒载体LV-CysLT_(1)R-EGFP并转染APP-HEK293细胞,激动剂YM17690单独处理或拮抗剂普仑司特和YM17690共同处理细胞,采用ELISA检测Aβ;Western blot检测APP、BACE1、PS1、PS2;细胞免疫荧光和Western blot检测CysLT_(1)R和NF-κB p65在细胞的分布。转染clathrin、β-arrestin-2、Rab-5、siRNA;Co-IP检测CysLT_(1)R和NF-κB p65相互作用。结果激活CysLT_(1)R增加细胞分泌Aβ、上调BACE1的表达、但对APP、PS1、PS2表达无明显影响,升高细胞核中CysLT_(1)R和NF-κB p65水平;敲减clathrin和β-arrestin-2抑制CysLT_(1)R激活后的上述效应;受体激活后CysLT_(1)R与NF-κB p65在细胞核内相互作用。结论激活CysLT_(1)R促进Aβ的生成,其作用机制与该受体发生核转位有关。 展开更多
关键词 CysLT_(1)R AΒ NF-κB p65 核转位 内化 BACE1
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细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究 被引量：2
3
作者 李海玉 郭爱华 +6 位作者 刘志锋 刘瑜 刘靖华 邓鹏 李志杰 刘亚伟 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1394-1399,1407,共7页
目的构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体,并研究其蛋白转导功能。方法在带His标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-HE(pET14b-His-EGFP)基础上,利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽(CPP)、连接子、核定位信号(... 目的构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体,并研究其蛋白转导功能。方法在带His标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-HE(pET14b-His-EGFP)基础上,利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽(CPP)、连接子、核定位信号(NLS)序列和EGFP的融合蛋白表达载体pET14b-HC(L)NE(pET14b-His-CPP-Linker-NLS-EGFP);经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后、用Ni2+亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中,荧光显微镜下观察并进行Westernblot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果酶切、测序证实载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核,并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体,建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统,为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。 展开更多
关键词 细胞穿透肽 增强型绿色荧光蛋白 核定位信号 蛋白转导 内化
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基于细胞穿透肽Tat的Cre-Loxp重组酶系统的改造 被引量：1
4
作者 邓军 刘芸 +4 位作者 谭婷 杨昭君 吴莉莉 李娟 姜勇 《感染．炎症．修复》 2013年第2期72-75,F0002,共5页
目的:构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并入核实现细胞水平的基因敲除。方法:在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-SBP-Tat-EGFP基础上,利用酶切连接的方法将... 目的:构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并入核实现细胞水平的基因敲除。方法:在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-SBP-Tat-EGFP基础上,利用酶切连接的方法将NLS-Cre片段插入带上述表达载体中,构建新的融合蛋白表达载体pET14b-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP;经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21(DE_3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用Ni^(2+)亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入到培养的cdc42基因两端带Loxp位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞中,在Zeiss荧光显微镜下观察蛋白转导效率,并用Western blot方法在蛋白水平检测并验证细胞水平目的基因敲除效果。结果:经酶切、基因测序证实重组载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;Zeiss荧光显微镜下观察融合蛋白穿透细胞膜并进入细胞,细胞在经融合蛋白内化处理后目的基因蛋白的表达量与对照组没加Tat融合蛋白比较有明显降低。结论:利用Tat细胞穿透肽成功构建了基于细胞穿透肽的带有NLS-Cre的Tat蛋白表达运输载体,建立了可携带Cre进入细胞核进行基因敲除的系统,说明利用该系统可以实现细胞水平的基因敲除。 展开更多
关键词 细胞穿透肽 增强型绿色荧光蛋白 核定位信号 内化 CRE重组酶
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