林烟草KUP/HAK/KT钾转运体基因NsHAK11的亚细胞定位与表达 被引量：14

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作者 宋毓峰 董连红 +7 位作者 靳义荣 史素娟 张良 刘朝科 冯祥国 胡晓明 王倩 刘好宝 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期1058-1071,共14页

【目的】应用生物信息学方法,分离和克隆烟草钾转运体KUP/HAK/KT家族新基因,对其进行亚细胞定位和表达分析,为开展烟草KUP/HAK/KT钾转运体的研究提供借鉴。【方法】通过生物信息学方法,搜索林烟草(Nicotiana sylvestris)和绒毛状烟草(N.... 【目的】应用生物信息学方法,分离和克隆烟草钾转运体KUP/HAK/KT家族新基因,对其进行亚细胞定位和表达分析,为开展烟草KUP/HAK/KT钾转运体的研究提供借鉴。【方法】通过生物信息学方法,搜索林烟草(Nicotiana sylvestris)和绒毛状烟草(N.tomentosiformis)基因组数据库,预测两种烟草中的钾转运体KUP/HAK/KT家族成员,构建系统进化树。根据所获结果,从林烟草中获得一个新的烟草KUP/HAK/KT家族基因。采用Wolf PSORT对蛋白的亚细胞定位进行预测,并利用农杆菌浸润法注射本生烟(N.benthamiana)叶片后激光共聚焦显微镜下观察,依据融合荧光蛋白在细胞内产生荧光的位置确定蛋白的亚细胞定位,用以验证预测结果;采用PLACE网站对基因的表达模式进行预测,并用荧光定量PCR分别研究其在盛花期林烟草不同器官的表达差异及低温、高温和低钾胁迫下苗期林烟草叶片中NsHAK11的表达变化,用以验证预测结果。【结果】预测出林烟草和绒毛状烟草KUP/HAK/KT钾转运体家族均含有19个成员,进化上分为4个Cluster(簇)。根据预测序列结果,从林烟草中克隆得到一个ClusterⅢ中的基因,其编码蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中AtKUP11的相似性最高,因此,将其命名为NsHAK11,其编码蛋白与已获得的2个烟草NrHAK1和NtHAK1的相似性仅为48%和49%,所以NsHAK11是一个新的烟草KUP/HAK/KT基因。Wolf PSORT预测显示NsHAK11主要定位于细胞质膜中。亚细胞定位试验中NsHAK11与GFP和DsRed2两种报告蛋白融合的定位结果均表明NsHAK11定位于细胞质膜中,与预测结果相符。利用PLACE网站对NsHAK11启动子分析得到,NsHAK11可表达与定位于根、花和胚芽组织中,受到低温、高温、干旱和激素等因素的影响。实时荧光定量PCR分析结果与预测结果基本一致:NsHAK11在盛花期林烟草各组织器官中均有表达,但表达水平存在强弱差异,其在主根中的表达量最高,在侧� 展开更多

关键词 林烟草 生物信息学 KUP HAK KT家族 NsHAK11 亚细胞定位 基因表达模式

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林烟草钾离子通道基因NKT6的克隆与表达定位分析 被引量：13

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作者 靳义荣 宋毓峰 +7 位作者 白岩 张良 董连红 刘朝科 冯祥国 胡晓明 王倩 刘好宝 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期1602-1611,共10页

Shaker家族钾离子通道在植物钾的吸收转运及其他生命过程中发挥重要作用。本研究利用同源克隆的策略从林烟草中获得一个Shaker家族钾离子通道基因,命名为NKT6(GenBank登录号为KC310448)。该基因cDNA序列全长2 317 bp,编码由681个氨基酸... Shaker家族钾离子通道在植物钾的吸收转运及其他生命过程中发挥重要作用。本研究利用同源克隆的策略从林烟草中获得一个Shaker家族钾离子通道基因,命名为NKT6(GenBank登录号为KC310448)。该基因cDNA序列全长2 317 bp,编码由681个氨基酸组成的蛋白,该蛋白与Shaker家族其他成员具有较高同源性。NKT6基因组CDS序列共含有11个外显子、10个内含子。系统进化树分析表明,NKT6蛋白是Shaker家族Group II的成员之一。荧光定量PCR分析发现,NKT6的表达量在林烟草的茎和腋芽中最高,其次在萼片、叶、花中,在根中最低。亚细胞定位结果表明,NKT6主要定位于细胞膜和核膜附近的内质网上。干旱与外源ABA胁迫处理后,NKT6的表达量均呈下降趋势。推测NKT6可能在林烟草气孔开放中发挥作用。 展开更多

关键词 钾离子通道 林烟草 NKT6 克隆表达 亚细胞定位

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烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定 被引量：8

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作者 李泽锋 魏攀 +8 位作者 夏玉珍 王中 武明珠 王燃 罗朝鹏 金立锋 杨军 林福呈 李锋 《烟草科技》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第6期1-8,共8页

为了揭示烟草栊牛儿基[牛 ]牛儿基焦磷酸合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）基因家族的特征和功能，利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员（大亚基... 为了揭示烟草栊牛儿基[牛 ]牛儿基焦磷酸合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）基因家族的特征和功能，利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员（大亚基7个、小亚基2个），林烟草、绒毛状烟草中分别鉴定出5个成员（大亚基4个、小亚基1个）。GGPP5的开放阅读框长度为999～1119bp，编码332~372个氨基酸，蛋白质分子量为36．2～40．7kD，等电点为5．41～8．32。大亚基和小亚基基因分别含有1个和2个外显子；大亚基与小亚基均具有DD（XX）。D和CXXXC保守性基序，但存在一定的差异。在进化过程中，烟草GGPPS家族可能发生了串联重复复制和片断复制；普通烟草GGPPS家族可能发生了基因丢失，NtabGGPPS1-1和NtabGGPPS1—2较其他成员进化速率快，同时可能受到了净化选择。 展开更多

关键词 普通烟草 林烟草 绒毛状烟草 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS) 基因家族 全基因组

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林烟草蛋白激酶NsylCIPK3基因的克隆与功能分析 被引量：4

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作者 董连红 史素娟 +7 位作者 S M Nuruzzaman Manik 苏玉龙 毛静静 王傚弘 周开燕 刘林 王倩 刘好宝 《植物遗传资源学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期633-639,共7页

CIPK蛋白激酶家族(CBL-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,与类钙调磷酸酶B亚基CBL(calcineurin B-like protein)蛋白共同形成CBL-CIPK网络,在植物的生长发育和逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。烟草中该家... CIPK蛋白激酶家族(CBL-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,与类钙调磷酸酶B亚基CBL(calcineurin B-like protein)蛋白共同形成CBL-CIPK网络,在植物的生长发育和逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。烟草中该家族的研究还比较少,本研究从林烟草(Nicotiana sylvestris)中获得一个CIPK家族基因,该基因与拟南芥和杨树中的CIPK3同源性分别为68.4%和87.5%,将其命名为Nsyl CIPK3。氨基酸序列分析表明,Nsyl CIPK3具有CIPK蛋白家族的典型结构特征,在N端和C端分别具有典型的激活环结构域和NAF结构域。进化树分析显示,Nsyl CIPK3属于CIPK蛋白亚家族Ⅱ。表达模式研究表明,该基因在林烟草的叶和腋芽中的表达量相对较高,在主根中的表达量次之,在侧根、茎、花瓣和萼片中的表达量相对较低,并且在烟草成熟期的叶中表达量明显升高。在高盐、紫外光和低钾胁迫下该基因的表达发生不同程度的上调。酵母双杂交结果显示,Nsyl CIPK3可与Nsyl CBL9互作。推测Nsyl CIPK3可能通过与Nsyl CBL9互作形成信号通路,激活下游靶蛋白,参与烟草响应非生物逆境胁迫的信号转导过程。 展开更多

关键词 林烟草 CIPK3 非生物逆境 信号转导 蛋白互作

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林烟草8个防卫反应信号蛋白编码基因的克隆及RNAi植物表达载体的构建 被引量：3

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作者 路子峰 张超 李彦忠 《草业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期1275-1282,共8页

为了分析林烟草(Nicotiana sylvestris)N’基因对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)产生抗性的信号途径,培育抗TMV植物新品种,选取PAD4、EDS1、Rar1、Sgt1、NPR1、Jar6、COI1、CTR1作为候选基因。以林烟草总RNA为模板,通过反转录... 为了分析林烟草(Nicotiana sylvestris)N’基因对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)产生抗性的信号途径,培育抗TMV植物新品种,选取PAD4、EDS1、Rar1、Sgt1、NPR1、Jar6、COI1、CTR1作为候选基因。以林烟草总RNA为模板,通过反转录分别克隆上述8个基因的片段,通过添加酶切位点以及酶切、连接和转化,成功构建了上述8个信号蛋白的RNAi载体。酶切验证结果表明,所构建的8个RNAi载体的结构正确,可以用于进一步的遗传转化试验,这为分析N’基因对TMV产生抗性所依赖的信号途径奠定了基础。 展开更多

关键词 林烟草 烟草花叶病毒 RNA干扰

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野生烟草甲羟戊酸激酶NsyMK基因克隆与序列分析 被引量：3

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作者 吕婧 刘贯山 +1 位作者 龚达平 孙玉合 《作物杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期75-79,共5页

甲羟戊酸激酶是植物中控制整个甲羟戊酸途径重要的限速酶,其代谢产物萜类物质是烟草芳香物质的主要来源。本研究采用同源克隆,利用RACE方法获得二倍体林烟草(Nicotiana sylvestris)甲羟戊酸激酶(NsyMK)的开放阅读框序列,对NsyMK序列进... 甲羟戊酸激酶是植物中控制整个甲羟戊酸途径重要的限速酶,其代谢产物萜类物质是烟草芳香物质的主要来源。本研究采用同源克隆,利用RACE方法获得二倍体林烟草(Nicotiana sylvestris)甲羟戊酸激酶(NsyMK)的开放阅读框序列,对NsyMK序列进行生物信息学分析,预测蛋白理化性质、二级结构、三维结构并推测其结构与功能。结果表明,克隆获得的林烟草NsyMK的开放阅读框全长为1158bp,编码385个氨基酸,预测分子量41.4kDa、等电点为6.05,GenBank登录号KC871597。蛋白质结构分析显示NsyMK存在典型GHMP激酶和甲羟戊酸激酶保守结构域。生物信息学预测NsyMK蛋白不含跨膜区与信号肽。本研究成功克隆并分析了一个未报道的林烟草NsyMK的全长序列,为进一步阐明栽培烟草中萜类代谢途径奠定基础。 展开更多

关键词 林烟草 甲羟戊酸激酶 萜类生物合成

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林烟草中与蛋白激酶NsylCIPK24a互作的NsylCBL蛋白家族成员的筛选鉴定

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作者 安璐璐 毛静静 +8 位作者 车昊昱 史素娟 董连红 许迪之 宋毓峰 徐方正 刘贯山 王倩 刘好宝 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2021年第16期5380-5388,共9页

植物CIPK蛋白激酶家族(CBL-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,该家族成员通过与上游的CBL蛋白(Calcineurin B-like protein)互作,形成CBL-CIPK信号系统,参与调控植物的生长发育和逆境胁迫响应过程。早期研... 植物CIPK蛋白激酶家族(CBL-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,该家族成员通过与上游的CBL蛋白(Calcineurin B-like protein)互作,形成CBL-CIPK信号系统,参与调控植物的生长发育和逆境胁迫响应过程。早期研究发现,拟南芥AtCIPK24分别通过与AtCBL4和AtCBL10互作,激活下游靶蛋白的活性,应对高盐胁迫。本研究前期从林烟草中获得了1个与拟南芥AtCIPK24同源的基因NsylCIPK24a,但与其互作的CBL家族成员及该激酶的具体功能尚不清楚。因此,本研究对林烟草CBL家族成员进行了全基因组预测;利用RT-PCR方法克隆CBL家族成员,并对其基因结构、蛋白保守结构域及组织表达情况进行了分析;通过酵母双杂交试验鉴定与NsylCIPK24a互作的林烟草CBL家族成员。结果表明,林烟草中共预测并克隆获得12个CBL家族成员;NsylCBL4、NsylCBL5、NsylCBL9和NsylCBL10 4个成员可与NsylCIPK24a在酵母中产生互作。推测烟草中可能也存在与拟南芥类似的应对盐胁迫的CBL-CIPK响应路径。本研究为解析林烟草NsylCIPK24a的功能、加深人们对烟草中CBL-CIPK调控通路的理解提供了研究数据。 展开更多

关键词 林烟草(nicotiana sylvestris) 钙信号 CBL CIPK24 酵母双杂交

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林烟草(Nicotiana sylvestris)K+通道蛋白基因NsAKT 1克隆及生物信息学分析 被引量：1

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作者 韦春 宋小潘 秦利军 《种子》 北大核心 2020年第11期19-25,共7页

AKT 1是一种重要的钾离子通道蛋白,负责植物体中K+的吸收和运输。为探讨烟草中AKT 1编码基因的序列结构和蛋白功能,以林烟草(N.sylvestris)为材料,以cDNA为模板对NsAKT 1基因进行同源克隆,同时对NsAKT 1编码蛋白的结构及功能进行预测。... AKT 1是一种重要的钾离子通道蛋白,负责植物体中K+的吸收和运输。为探讨烟草中AKT 1编码基因的序列结构和蛋白功能,以林烟草(N.sylvestris)为材料,以cDNA为模板对NsAKT 1基因进行同源克隆,同时对NsAKT 1编码蛋白的结构及功能进行预测。结果表明,NsAKT 1基因的开放阅读框全长2682 bp,可编码893个AA,分子量为100.375 kDa。利用ProtParam、SignalP 4.0软件及Tmpred等软件对NsAKT 1蛋白的结构预测显示,该蛋白是一个亲水性的酸性跨膜蛋白,无信号肽,为非分泌型蛋白。NsAKT 1主要定位于内质网膜、高尔基体、质膜等部位,其二级结构由48个α螺旋(α-helix)、35个延伸链(extended strand)、36个β转角(β-turn)及59个无规则卷曲(random coil)组成,三者间通过无规则卷曲(random coil)进行连接。本研究为进一步探讨NsAKT 1的生物学功能提供了理论依据。 展开更多

关键词 林烟草 NsAKT 1 基因克隆 生物信息学

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林烟草NsylCBL10互作蛋白激酶NsylCIPK的鉴定与分析 被引量：1

9

作者 许迪之 史素娟 +6 位作者 毛静静 张鸽 李书贵 Muhammad Asim Zia Ullah 刘好宝 王倩 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2018年第19期6250-6260,共11页

植物中的类钙调神经素B亚基蛋白CBL (calcineurin B-like protein)家族成员与其互作蛋白激酶CIPK (CBL-interacting kinase protein)家族成员形成了复杂精细的CBL-CIPK信号调控网络,在解码生物和非生物胁迫激发的钙信号及信号的进一步... 植物中的类钙调神经素B亚基蛋白CBL (calcineurin B-like protein)家族成员与其互作蛋白激酶CIPK (CBL-interacting kinase protein)家族成员形成了复杂精细的CBL-CIPK信号调控网络,在解码生物和非生物胁迫激发的钙信号及信号的进一步传导中发挥重要作用。CBL家族成员CBL10参与植物抵抗高盐胁迫、应对病菌侵染、参与分生组织和花器官发育、调节离子平衡等多个过程,对其下游互作CIPK家族成员的筛选与鉴定对于明确上述调节机制至关重要。为了鉴定林烟草(Nicotiana sylvestris) NsylCBL10下游互作NsylCIPK家族成员,本研究首先以拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtCIPK家族成员和水稻(Oryza sativa) OsCIPK家族成员基因的CDS序列为检索序列,利用NCBI和中国烟草基因组数据库对林烟草中可能存在的NsylCIPK家族成员进行了预测;然后通过RT-PCR方法对预测到的NsylCIPK家族成员进行了克隆并利用生物学分析软件对其基因结构和蛋白保守结构域进行了分析;最后通过酵母双杂交实验鉴定了与Nsyl CBL10互作的NsylCIPK家族成员。结果表明,在林烟草中可能存在28个NsylCIPK家族成员,实际克隆获得了20个NsylCIPK家族成员,在酵母双杂交体系中与NsylCBL10互作的只有1个NsylCIPK家族成员Nsyl CIPK14a。本研究为解析林烟草及其他物种中CBL-CIPK信号通路的调节功能提供了试验数据。 展开更多

关键词 林烟草 钙信号 NsylCBL10 NsylCIPK 酵母双杂交

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林烟草NsylCBL10启动子的克隆及功能分析 被引量：1

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作者 毛静静 王倩 +4 位作者 史素娟 张鸽 许迪之 李书贵 刘好宝 《中国烟草学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第2期97-105,120,共10页

【目的】探究林烟草(Nicotiana sylvestris)类钙调神经素B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)基因家族成员Nsyl CBL10的启动子在烟草不同生长发育过程及光信号刺激下的活性变化。【方法】克隆Nsyl CBL10启动子并初步预测其顺式... 【目的】探究林烟草(Nicotiana sylvestris)类钙调神经素B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)基因家族成员Nsyl CBL10的启动子在烟草不同生长发育过程及光信号刺激下的活性变化。【方法】克隆Nsyl CBL10启动子并初步预测其顺式作用元件;构建Nsyl CBL10启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的融合表达载体并将其转入普通烟草(Nicotiana tabacum),获得转Nsyl CBL10pro::GUS的纯合材料;利用所获转基因材料探究Nsyl CBL10启动子在种子萌发期、幼苗期和成熟期的组织特异活性和在幼苗下胚轴的光诱导活性。【结果】预测结果表明,Nsyl CBL10启动子含有与组织特异性和响应光信号、植物激素和胁迫等相关的顺式作用元件;组织化学染色试验表明,Nsyl CBL10启动子驱动的GUS基因在种子萌发期主要在子叶节区-根过渡区、根尖表达,子叶伸展期主要在子叶、子叶节区-根过渡区和根尖表达,十字期主要在叶片中表达,成熟期在柱头、成熟的花药、侧根根尖和侧根根基部表达量较高;幼苗下胚轴中,Nsyl CBL10启动子驱动的GUS的基因表达在光下受到抑制,黑暗下被增强。【结论】Nsyl CBL10启动子活性在烟草不同发育期的组织中呈现动态变化。在烟草分生能力强的部位和成熟期的花器官中其启动活性较强,在幼苗下胚轴中的启动子活性受到光信号的调控。 展开更多

关键词 林烟草 NsylCBL10启动子 GUS活性 组织特异性

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林烟草Sigma因子Nssig2的生物信息学分析

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作者 刘红云 程思远 +2 位作者 程金金 范会 刘征 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期1672-1677,共6页

在植物体内,sigma因子由一个较小的核基因家族编码,并在叶绿体中发挥转录起始的作用。本研究通过生物信息学的方法,对林烟草的sig2基因及其蛋白序列进行了一系列的结构和功能分析。结果分析表明,林烟草的Nssig2为不稳定蛋白,不含信号肽... 在植物体内,sigma因子由一个较小的核基因家族编码,并在叶绿体中发挥转录起始的作用。本研究通过生物信息学的方法,对林烟草的sig2基因及其蛋白序列进行了一系列的结构和功能分析。结果分析表明,林烟草的Nssig2为不稳定蛋白,不含信号肽序列,不是分泌蛋白,也不是细胞膜蛋白,最可能定位在叶绿体;二级结构预测表明林烟草Nssig2蛋白中的二级构象主要有两种,即α-螺旋和无规则卷曲,各自所占比例分别为50.34%和29.81%。本研究能够对于深入研究烟草sig2因子的功能及叶绿体转录机制提供线索。 展开更多

关键词 生物信息学 sigma因子 林烟草

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烟草NtKEA4基因的克隆、生物信息学及表达分析

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作者 李佳皓 吕承承 +2 位作者 罗银 鲁黎明 李立芹 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第18期5946-5952,共7页

K^+efflux antiporter (KEA)是一类钾离子反向转运蛋白,属于一价阳离子/质子反向转运体超家族,对植物细胞钾离子的积累和平衡具有重要作用。从烟草品种K326中利用同源克隆的方法获得一个钾离子反向转运蛋白基因,序列分析表明该基因全长1... K^+efflux antiporter (KEA)是一类钾离子反向转运蛋白,属于一价阳离子/质子反向转运体超家族,对植物细胞钾离子的积累和平衡具有重要作用。从烟草品种K326中利用同源克隆的方法获得一个钾离子反向转运蛋白基因,序列分析表明该基因全长1 749 bp,编码一个由582个氨基酸残基组成的酸性疏水蛋白。生物信息学分析预测该蛋白分子量为62.1 kD,理论等电点为5.50,含有11个跨膜区。同源性分析结果显示,该基因编码蛋白与美花烟草(Nicotiana sylvestris)钾离子转运体KEA4、辣椒(Capsicum baccatum)钾离子转运体KEA4等具有较高的同源性,所以将该基因命名为NtKEA4。表达模式分析表明,NtKEA4基因在组织中均有表达,但主要在烟草茎中表达,其表达受低钾、高盐、脱落酸(ABA)、低温等非生物胁迫条件的诱导。 展开更多

关键词 烟草(nicotiana sylvestris) KEA4 钾离子转运体 表达分析

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