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大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应 被引量：4
1
作者 张红曼 李剑波 +6 位作者 晏玲飞 解敏 徐宽枫 许馨予 陈恒 杨涛 陈家伟 《江苏医药》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期745-748,共4页
目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和... 目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组)。RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况。结果与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P<0.01或P<0.05)。结论成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体。其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加。 展开更多
关键词 neuritin基因 shRNA载体 慢病毒转染 雪旺细胞 凋亡
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广西巴马小型猪Neuritin基因克隆与生物信息学分析及真核表达载体的构建 被引量：1
2
作者 李龙 司景磊 +6 位作者 夏攀洁 何剑雄 吴延军 程晓芳 吴敏 徐文文 兰干球 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期557-563,共7页
本研究旨在通过克隆广西巴马小型猪的Neuritin基因并进行生物信息学分析,为后续对Neuritin的研究奠定基础。实验成功获得Neuritin基因的编码区序列,并对Neuritin基因编码区序列和预测蛋白序列进行分析。结果表明,广西巴马小型猪的Neuri... 本研究旨在通过克隆广西巴马小型猪的Neuritin基因并进行生物信息学分析,为后续对Neuritin的研究奠定基础。实验成功获得Neuritin基因的编码区序列,并对Neuritin基因编码区序列和预测蛋白序列进行分析。结果表明,广西巴马小型猪的Neuritin基因编码142个氨基酸,其中含有2个磷酸化位点和2个跨膜信号结构以及1个结构保守域。通过双酶切技术成功获得重组质粒pEGFP-N1-Neuritin并转染到N2a细胞中,在24 h拍照发现N2a细胞发出荧光,证明Neuritin真核表达载体构建成功。 展开更多
关键词 广西巴马小型猪 neuritin基因 信息学分析 pEGFP-N1-neuritin
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Neuritin基因高表达系统构建及转染大鼠雪旺细胞的鉴定 被引量：2
3
作者 解敏 李剑波 +6 位作者 晏玲飞 颜莓 徐宽枫 许馨予 陈恒 杨涛 陈家伟 《江苏医药》 CAS 北大核心 2013年第9期993-995,共3页
目的构建neuritin基因的高表达系统,观察其转染雪旺细胞后neuritin的表达。方法根据大鼠neuritin mRNA序列体外合成编码序列(CDS区),构建到pGH载体,与酶切后的GV208-绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体片段进行连接、转化、酶切及测序鉴定重... 目的构建neuritin基因的高表达系统,观察其转染雪旺细胞后neuritin的表达。方法根据大鼠neuritin mRNA序列体外合成编码序列(CDS区),构建到pGH载体,与酶切后的GV208-绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体片段进行连接、转化、酶切及测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆,转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞。将雪旺细胞分为三组:空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)、高表达组(C组)。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞neuritin的表达。结果大鼠neuritin正确插入慢病毒载体,C组neuritin mRNA水平显著高于A组、B组(P<0.01)。检测到neuritin蛋白与GFP的融合蛋白。结论成功构建neuritin慢病毒高表达系统;其转染的雪旺细胞neuritin表达升高。 展开更多
关键词 neuritin基因 慢病毒高表达系统 雪旺细胞
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Neuritin基因在单眼剥夺成年大鼠视皮层中的表达 被引量：2
4
作者 田春慧 陈霞 +1 位作者 陈静 王玉川 《眼科研究》 CSCD 北大核心 2010年第4期334-337,共4页
目的研究单眼剥夺(MD)视皮层neuritin mRNA的表达。方法35只Wistar大鼠分为正常对照组、MD组和反缝合(RS)组,缝合14日龄大鼠右眼睑建立MD模型,RS组大鼠缝合单眼至90日龄时进行反缝合,并持续暴露于灯光中6、12、24、48 h和1周,其余2组大... 目的研究单眼剥夺(MD)视皮层neuritin mRNA的表达。方法35只Wistar大鼠分为正常对照组、MD组和反缝合(RS)组,缝合14日龄大鼠右眼睑建立MD模型,RS组大鼠缝合单眼至90日龄时进行反缝合,并持续暴露于灯光中6、12、24、48 h和1周,其余2组大鼠至90日龄时直接取左侧大脑视皮层,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测所有大鼠视皮层neuritin mRNA的表达情况。结果不同组大鼠视皮层中neuritin mRNA表达量的总体差异有统计学意义(F=19.235,P<0.05)。MD组大鼠视皮层中neuritin mRNA的表达量低于正常对照组,差异有统计学意义(t=-0.097,P<0.05);RS 6 h组大鼠视皮层中neuritin mRNA的表达量明显高于MD组,差异有统计学意义(t=-0.028,P<0.05)。RS12、24、48 h组大鼠视皮层中neuritin mRNA的表达量明显高于MD组,差异均有统计学意义(t=-0.046,t=-0.064,t=-0.065;P<0.05)。Neuritin mRNA的表达在实验24 h达到高峰,然后逐渐下降,但RS1周组与MD组neuritin mRNA的表达比较,差异有统计学意义(t=-0.037,P<0.05)。结论Neuritin mRNA在MD成年大鼠和RS不同时间大鼠视皮质表达呈动态变化,提示年龄超过视觉发育敏感期的MD成年大鼠的视皮层仍具有一定程度的可塑性。 展开更多
关键词 neuritin基因 视皮质可塑性 单眼形觉剥夺 视觉发育
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Neuritin基因对视网膜神经节细胞调节以及大鼠受损视神经的修复作用 被引量：1
5
作者 伟伟 杨佳 《临床和实验医学杂志》 2017年第2期108-112,共5页
目的探讨Neuritin基因对视网膜神经节细胞调节以及大鼠受损视神经的修复作用。方法采用视神经夹伤法制备大鼠视神经损伤模型,分别于视神经损伤1 d和7 d后取材。对照组(只分离出视神经,不夹伤)、1 d和7 d组各含有5只大鼠。采用实时逆转录... 目的探讨Neuritin基因对视网膜神经节细胞调节以及大鼠受损视神经的修复作用。方法采用视神经夹伤法制备大鼠视神经损伤模型,分别于视神经损伤1 d和7 d后取材。对照组(只分离出视神经,不夹伤)、1 d和7 d组各含有5只大鼠。采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同组织中Neuritin基因的mRNA表达含量。采用蛋白质印迹法检测检测不同组织中Neuritin蛋白表达含量,采用免疫组织化学方法检测组织中Neuritin基因的表达情况,采用慢病毒技术在体过表达Neuritin基因以研究Neuritin基因的功能,采用免疫荧光技术观察在体组织中视网膜神经节细胞活性,采用CCK-8试剂盒离体检测视网膜神经节细胞的活性。结果 RT-PCR结果显示,与对照组相比,大鼠视神经夹伤1d后Neuritin基因的mRNA表达显著上升,大鼠视神经夹伤7 d后Neuritin基因的mRNA含量有所回落,但依旧显著高于对照组。免疫组织化学实验结果表明,与对照组相比大鼠视神经夹伤1 d后Neuritin基因表达含量表达显著上升。免疫印迹法结果显示,与对照组相比,大鼠视神经夹伤1 d后Neuritin基因的蛋白表达显著上升,大鼠视神经夹伤7 d后Neuritin基因的蛋白含量有所回落,但依旧显著高于对照组。LV-Nml组视网膜神经节细胞存活概率显著高于对照组以及LV-RFP转染组。LV-Nm1组对大鼠受损视神经的修复效果显著好于对照组以及LV-RFP转染组。10 ng/ml、30 ng/ml以及100 ng/ml浓度的Neuritin蛋白都可以显著促进视网膜神经节细胞的活性。结论 Neuritin基因在受损视神经中表达含量上升,过表达Neuritin基因可以提高视网膜神经节细胞活性、有效修复大鼠受损视神经。 展开更多
关键词 大鼠 视神经损伤 neuritin基因 视网膜神经节细胞 基因治疗 修复作用
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Neuritin真核表达载体的构建及鉴定 被引量：1
6
作者 钟晨 罗星 +1 位作者 于娜 黄瑾 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2011年第5期588-591,共4页
Neuritin(CPG15)是一种神经营养因子,能促进神经突起生长,为了探讨Neuritin可能的作用机制,本研究构建了人类neuritin基因的真核表达载体。采用PCR技术扩增编码人neuritin基因cDNA全长序列,并纯化回收,酶切、连接入真核表达载体pcDNA3.1... Neuritin(CPG15)是一种神经营养因子,能促进神经突起生长,为了探讨Neuritin可能的作用机制,本研究构建了人类neuritin基因的真核表达载体。采用PCR技术扩增编码人neuritin基因cDNA全长序列,并纯化回收,酶切、连接入真核表达载体pcDNA3.1(-)A中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆pcDNA3.1(-)A-neuritin扩增后,提取质粒,进行双酶切鉴定以及DNA测序鉴定。结果显示,构建的重组质粒pcDNA3.1(-)A-neuritin含有450bp neuritin片段,且重组质粒所含的neuritin读框片段与GenBank NM 016588.2序列同源性100%。由此可知:成功构建了pcDNA3.1(-)A-neuritin真核表达载体,为进一步研究该基因的功能及作用机制奠定良好的实验基础。 展开更多
关键词 pcDNA3.1(-)A neuritin基因 真核表达载体
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骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠的构建
7
作者 刘远志 周吉银 +2 位作者 张祚 李和教 黄毅岚 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2018年第10期1624-1627,1632,共5页
目的构建骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠并进行繁殖、基因型鉴定,为进一步研究neuritin蛋白治疗外周神经病变奠定基础。方法将2对转基因小鼠loxp-stop-loxp-neuritin与转基因小鼠lyz-Cre/+进行饲养和繁殖,对其子鼠提取尾组织DNA,采... 目的构建骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠并进行繁殖、基因型鉴定,为进一步研究neuritin蛋白治疗外周神经病变奠定基础。方法将2对转基因小鼠loxp-stop-loxp-neuritin与转基因小鼠lyz-Cre/+进行饲养和繁殖,对其子鼠提取尾组织DNA,采用PCR方法鉴定小鼠基因型,获取基因型neuritinloxp/+_lyz-Cre/+即为骨髓特异性高表达neuritin小鼠。选择C57BL/6j野生型小鼠作为对照,并通过组织免疫荧光检测小鼠骨髓neuritin的表达量,进一步验证neuritin loxp/+_lyz-Cre/+小鼠的准确性。结果 2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,相互杂交其子鼠基因型为neuritin loxp/+_lyz-Cre/+、neuritin loxp/-_lyz-Cre/+、neuritin loxp/+_lyz-Cre/-、neuritin loxp/-_lyz-Cre/-,其繁殖结果基本符合孟德尔遗传定律。免疫荧光结果显示:neuritin loxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓neuritin表达量显著高于野生型小鼠(P<0.05)。结论 PCR是小鼠基因型鉴定的可靠方法。雄性lyz-Cre/+小鼠与雌性neuritin loxp/+小鼠交配是获得neuritin loxp/+_lyz-Cre/+小鼠的有效途径。 展开更多
关键词 neuritin基因 转基因小鼠 Lyz-Cre Cre-Loxp系统 基因型鉴定
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Neuritin耳蜗支持细胞条件性敲除转基因小鼠模型的构建及鉴定
8
作者 黄娟 孙筱品 +4 位作者 杨磊 胡俊豪 张译心 汪海燕 洪玉 《毒理学杂志》 CAS CSCD 2021年第2期123-127,共5页
目的应用Cre-LoxP重组酶系统构建Neuritin耳蜗支持细胞特异性敲除的Sox2-CreER:Neuritin^(flox/flox)转基因小鼠模型,初步探讨敲除Neuritin对小鼠耳蜗听功能的影响。方法采用Cre-LoxP重组酶系统,将Neuritin^(flox/flox)小鼠和Sox2-CreE... 目的应用Cre-LoxP重组酶系统构建Neuritin耳蜗支持细胞特异性敲除的Sox2-CreER:Neuritin^(flox/flox)转基因小鼠模型,初步探讨敲除Neuritin对小鼠耳蜗听功能的影响。方法采用Cre-LoxP重组酶系统,将Neuritin^(flox/flox)小鼠和Sox2-CreER工具鼠进行饲养和繁殖,对其子鼠提取尾组织DNA,采用PCR方法鉴定小鼠基因型,获取基因型Sox2-CreER:Neuritin^(flox/flox)即为耳蜗支持细胞条件性敲除Neuritin的转基因小鼠。对其进行听功能检测,选择听力正常的Sox2-CreER:Neuritin^(flox/flox)小鼠作为实验小鼠,连续3 d腹腔注射tamoxifen诱导CreER发挥作用后,分别于诱导后第4和7天,检测Neuritin敲除小鼠的听力变化,并通过组织免疫荧光检测其耳蜗支持细胞中Neuritin的表达量,进一步验证Sox2-CreER:Neuritin^(flox/flox)小鼠模型的构建效果。结果成功构建耳蜗支持细胞条件性敲除Neuritin基因小鼠模型,该小鼠存活且有繁殖能力。听功能测试结果显示在耳蜗支持细胞内特异性敲除Neuritin基因的小鼠听力阈值与对照组相比明显上升(P<0.05),但都处于正常听力范围内。耳蜗细胞组织形态与野生型相似,免疫荧光结果显示Sox2-CreER:Neuritin^(flox/flox)小鼠耳蜗内Neuritin的表达量明显低于对照组。结论应用Cre-LoxP重组酶系统成功构建了耳蜗支持细胞中条件性敲除Neuritin基因的Sox2-CreER:Neuritin^(flox/flox)转基因小鼠模型,为在动物水平研究Neuritin在听力损失的可能恢复机制中的作用提供一定的研究平台基础。 展开更多
关键词 neuritin基因 Cre-LoxP技术 耳蜗支持细胞 转基因小鼠
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Neuritin过表达对BMSCs增殖的影响
9
作者 王红颖 徐芬 黄瑾 《农垦医学》 2011年第4期289-292,共4页
目的:为全面了解Neuritin的功能,探讨Neuritin对细胞增殖的影响。方法:利用已构建Neuritin真核表达载体pcDNA3.1(-)A-Neuritin,转染BMSCs,通过MTT、细胞计数等观察Neuritin过表达对BMSCs增殖的影响。结果:MTT检测结果显示,BMSCsneu约在... 目的:为全面了解Neuritin的功能,探讨Neuritin对细胞增殖的影响。方法:利用已构建Neuritin真核表达载体pcDNA3.1(-)A-Neuritin,转染BMSCs,通过MTT、细胞计数等观察Neuritin过表达对BMSCs增殖的影响。结果:MTT检测结果显示,BMSCsneu约在第3天进入对数生长期,第5天进入平台期;细胞计数结果显示,Neuritin过表达与BMSCs的数目呈负相关,并且在各检测点上,稳定表达Neuritin的BMSCs数目均低于对照组。结论:Neu-ritin过表达抑制了BMSCs的增殖。 展开更多
关键词 pcDNA3.1(-)A neuritin基因 细胞增殖
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