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绵羊NYD-SP27基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定 被引量:1
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作者 陈云蕾 袁力明 +3 位作者 李娜 马亚茹 徐锦凤 赛务加甫 《动物医学进展》 北大核心 2018年第5期31-37,共7页
构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiL... 构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 nyd-sp27基因 干扰片段 慢病毒 HEK-293FT
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NYD-SP27基因对绵羊精子质量及精子中cAMP信号通路的影响 被引量:1
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作者 陈云蕾 吴雨红 +3 位作者 赵新霞 袁力明 李娜 赛务加甫 《畜牧与兽医》 北大核心 2020年第2期18-22,共5页
为了研究睾丸发育特异性蛋白-27基因(testis development specific protein gene 27,NYD-SP27)基因对绵羊精子活率、畸形率及精子内cAMP信号通路中酶类表达量影响,分别将NYD-SP27基因的过表达载体、干扰载体质粒注射到绵羊的睾丸中,通... 为了研究睾丸发育特异性蛋白-27基因(testis development specific protein gene 27,NYD-SP27)基因对绵羊精子活率、畸形率及精子内cAMP信号通路中酶类表达量影响,分别将NYD-SP27基因的过表达载体、干扰载体质粒注射到绵羊的睾丸中,通过电刺激采精法采集绵羊精液,对绵羊精子进行染色,检测其活率、畸形率,并通过ELISA方法检测精子中cAMP信号通路中相关酶类的表达量。结果显示:与对照组相比,过表达组精子活率变化不明显,而干扰组有较明显的升高,精子畸形率差异不明显;与过表达组、干扰组绵羊精子中环磷酸腺苷酸的表达量差异极显著(P<0.01);与过表达组绵羊精子中PKA的表达量差异不显著(P>0.05),而干扰组显著升高(P<0.05)。综上所述,干扰NYD-SP27基因对精子中环磷酸腺苷酸和PKA的表达具有调控作用,并对绵羊精子活率具有一定的提高效果。本研究为进一步研究NYD-SP27基因调控绵羊精子发生及获能的分子机制奠定基础。 展开更多
关键词 nyd-sp27基因 过表达 干扰 活率 cAMP信号通路
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绵羊NYD-SP27基因真核表达载体的构建及表达 被引量:1
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作者 陈云蕾 赵新霞 +2 位作者 袁力明 李娜 赛务加甫 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第18期50-53,244,共5页
为了构建绵羊NYD-SP27基因重组真核表达载体,进一步研究该基因的功能,试验根据GenBank中公布的绵羊NYD-SP27基因序列设计引物,克隆绵羊NYD-SP27基因,将其连接至真核表达载体pmcherry-n1中,在目的基因和红色荧光蛋白之间通过猪捷申病毒2... 为了构建绵羊NYD-SP27基因重组真核表达载体,进一步研究该基因的功能,试验根据GenBank中公布的绵羊NYD-SP27基因序列设计引物,克隆绵羊NYD-SP27基因,将其连接至真核表达载体pmcherry-n1中,在目的基因和红色荧光蛋白之间通过猪捷申病毒2A肽(P2A)连接以实现共表达,将重组质粒pmcherry-Flag-NYDSP-P2A转染至HEK-293FT细胞中,48 h后通过荧光显微镜可观察红色荧光,构建NYD-SP27真核表达载体成功。结果表明:重组质粒pmcherry-Flag-NYDSPP2A在HEK-293FT细胞中得以表达;P2A在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中已起到自我剪切的作用。 展开更多
关键词 绵羊 nyd-sp27基因 P2A 转染 pmcherry-n1 自我剪切
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新疆哈萨克羊NYD-SP27基因的克隆及序列分析
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作者 加米拉.吐尔逊 陈云蕾 +2 位作者 吾热力哈孜.哈孜汗 马亚茹 赛务加甫 《石河子大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2018年第1期45-50,共6页
本研究通过新疆哈萨克羊NYD-SP27基因的克隆及序列分析,为研究绵羊NYD-SP27表达调控机制奠定基础。根据Genbank中公布的人类的NYD-SP27基因序列设计引物,本研究以新疆哈萨克羊的睾丸组织的总DNA为模板,采用RT-PCR扩增方法对绵羊NYD-SP2... 本研究通过新疆哈萨克羊NYD-SP27基因的克隆及序列分析,为研究绵羊NYD-SP27表达调控机制奠定基础。根据Genbank中公布的人类的NYD-SP27基因序列设计引物,本研究以新疆哈萨克羊的睾丸组织的总DNA为模板,采用RT-PCR扩增方法对绵羊NYD-SP27基因序列进行研究。结果显示:哈萨克羊NYD-SP27基因全长为1901 bp,其中只含有1617 bp组成的开放阅读框(ORF),共编码538个氨基酸;相对分子质量61995.66,理论PI值为6.16,正电荷残基数(Arg+Lys)为61,负电荷残基数(Asp+Glu)为67;分子式C2798H4319N737O819S19;体外半衰期为30 h,不稳定系数46.96(不稳定);总平均吸水性-0.403。结论:哈萨克羊NYD-SP27基因属于PLCζ家族;同时将所得序列已提交到Gene Bank(登录号:KX905090)。 展开更多
关键词 哈萨克羊 nyd-sp27基因 基因克隆 序列分析
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绵羊NYD-SP27基因在BHK-21细胞中的稳定表达及其特征鉴定
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作者 马亚茹 胡广东 +4 位作者 王红红 加米拉 徐锦凤 陈创夫 赛务加甫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期637-644,共8页
旨在构建稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞株,对NYD-SP27基因的表达特征进行分析,为进一步研究NYD-SP27基因功能奠定基础。本研究克隆绵羊NYD-SP27基因,并将其插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,利用猪捷申病毒2A肽(P2A)将NYD-SP27... 旨在构建稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞株,对NYD-SP27基因的表达特征进行分析,为进一步研究NYD-SP27基因功能奠定基础。本研究克隆绵羊NYD-SP27基因,并将其插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,利用猪捷申病毒2A肽(P2A)将NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白连接以实现共表达,将重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转染至BHK-21细胞中,经G418筛选获得稳定转基因细胞株,利用RT-PCR、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot对NYD-SP27基因的表达进行鉴定。结果表明,NYD-SP27基因稳定整合至宿主细胞基因组;NYD-SP27蛋白能够在BHK-21细胞中正常表达,分子大小约为63ku;在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中,P2A成功自我剪切。本研究成功构建了绵羊NYD-SP27基因的真核表达载体,建立了稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞系。 展开更多
关键词 绵羊nyd-sp27基因 稳定表达 BHK-21细胞 P2A
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