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广东省登革病毒的分子流行病学研究 被引量：20
1
作者 方美玉 赵文忠 +5 位作者 蒋廉华 陈翠华 刘建伟 白志军 田小东 林立辉 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期326-329,共4页
目的　通过对广东省 90年代以来流行的登革病毒分子流行病学研究 ,初步了解我国毒株的可能来源。方法　采用RT PCR方法扩增广东省不同年份分离的登革病毒 (DEN) 1型和 2型NS1部分基因片段 ,然后进行克隆测序。测序后的基因片段与国际上... 目的　通过对广东省 90年代以来流行的登革病毒分子流行病学研究 ,初步了解我国毒株的可能来源。方法　采用RT PCR方法扩增广东省不同年份分离的登革病毒 (DEN) 1型和 2型NS1部分基因片段 ,然后进行克隆测序。测序后的基因片段与国际上已知的多个DEN1和DEN2相应的序列进行比较 ,并以核苷酸的差异在 6 %以上作为基因亚型分型的标准。结果　①广州 1991年分离的DEN1(GD0 3/91)与潮洲 1995年分离的DEN1(GD2 3/95 )同源性很高 ,为 97% ,属同一基因亚型 ,而两者与从潮洲 1997年分离的DEN1(GD14/97)同源性均为 93% ,分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示 :GD0 3/91和GD2 3/95可能来自东南亚或瑙鲁等地 ,GD14/97可能来自新加坡。②佛山市 1993年分离的DEN2 (GD0 6 /93)和南海市 1998年分离的DEN2 (GD0 1/98)同源性为 93% ,分属不同的基因亚型。基因系统树分析提示 :GD0 1/98与泰国流行株ThNH P2 8/93株共享序列非常接近 ,核苷酸同源性为 98% ,氨基酸同源性为 10 0 % ,因此推测GD0 1/98可能来源于泰国。结论　广东省 90年代以来流行的登革热来源于不同的传染源。 展开更多
关键词 登革病毒 ns1基因 基因序列分析 同源性 分子流行病学 登革热
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浙江省登革热暴发疫情的病原学和分子生物学研究 被引量：22
2
作者 严菊英 卢亦愚 +6 位作者 翁景清 茅海燕 冯燕 史雯 徐昌平 李婵 谢荣辉 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期339-344,共6页
2004年浙江省慈溪市发生了由输入病例引起的登革热暴发,共报告病例113例。为查明病因,从分子水平分析流行毒株的生物学特征,对疑似患者血清测定了登革病毒IgM和IgG抗体,并用C6/36和BHK-21细胞分离登革病毒。同时采用RT-PCR方法扩增病毒... 2004年浙江省慈溪市发生了由输入病例引起的登革热暴发,共报告病例113例。为查明病因,从分子水平分析流行毒株的生物学特征,对疑似患者血清测定了登革病毒IgM和IgG抗体,并用C6/36和BHK-21细胞分离登革病毒。同时采用RT-PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后又分别进行序列测定,并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析。结果表明,从患者血清中检测到登革病毒IgM和IgG抗体及登革I型病毒核酸;从18份疑似患者血清中分离到10株登革I型病毒;浙江登革I型分离株(ZJ/07/04)与登革I型夏威夷株、广东株和泰国株的E基因氨基酸同源性分别为96.3%、98.8%和99.2%,而与登革Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68.3%、77.5%和62.8%。基因进化树显示浙江省登革病毒分离株与泰国株亲缘关系最近,在进化树的同一分支上。从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该次疫情的病因为由泰国输入的登革I型病毒。 展开更多
关键词 暴发 登革Ⅰ型 E基因 ns1基因 序列分析
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猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆及序列分析 被引量：16
3
作者 吴丹 仇华吉 +6 位作者 李昌文 薛强 周艳君 李景鹏 韩孝成 刘慧敏 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期241-244,共4页
猪细小病毒 (Porcineparvovirus,PPV)SY_99株由本室分离 ,提取SY_99株的基因组DNA ,利用PCR扩增出全长NS1基因 ,将该基因克隆到原核表达载体pET2 8a中并测序。结果表明 ,NS1基因全长 1989bp ,编码 6 6 2个氨基酸。氨基酸序列中含有在PP... 猪细小病毒 (Porcineparvovirus,PPV)SY_99株由本室分离 ,提取SY_99株的基因组DNA ,利用PCR扩增出全长NS1基因 ,将该基因克隆到原核表达载体pET2 8a中并测序。结果表明 ,NS1基因全长 1989bp ,编码 6 6 2个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中发挥重要作用的保守基序GKRN ,并有 3个潜在的糖基化位点 ,分别位于 35 6～ 35 9、4 4 6～ 4 4 9、5 13～ 5 16位氨基酸处。SY_99株NS1基因与其它PPV毒株NADL2_1、NADL2_2、Kresse株核苷酸同源性分别为 98%、99%、99% ,氨基酸同源性分别为 97%、99%、99%。 展开更多
关键词 猪 细小病毒 ns1基因
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H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立 被引量：9
4
作者 杨涛 刘明 +2 位作者 张云 刘春国 杜绍范 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2005年第8期585-589,共5页
采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒(AIV)A/Goose/HLJ/p46/2003(H5N1)的NS1基因,将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析,表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE... 采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒(AIV)A/Goose/HLJ/p46/2003(H5N1)的NS1基因,将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析,表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示,重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后,经0.3mmol/L的IPTG诱导,融合蛋白MBP-NS1得到大量表达,融合蛋白以可溶形式存在,分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明,融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应,而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法,为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒 ns1基因 原核表达 酶联免疫吸附试验
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H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS基因的克隆及序列分析 被引量：10
5
作者 杨涛 刘明 +1 位作者 张云 杜绍范 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2005年第1期5-9,共5页
采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%～98.7%,氨基酸同源率为82.6%～97.8%。与其他... 采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%～98.7%,氨基酸同源率为82.6%～97.8%。与其他毒株比较A Goose HLJ P46 2003(H5N1)和A Goose HLJ G2 2003(H5N1)株NS基因在第264～278位处发生了15个核苷酸缺失;A Goose Jilin W2 2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T C突变,成为终止密码子,造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在;H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。 展开更多
关键词 禽流感病毒 ns1基因 克隆 序列分析
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乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1基因片段的克隆、测序与表达 被引量：9
6
作者 王祥 陈焕春 +3 位作者 何启盖 吴斌 贾杏林 吴美洲 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期240-244,共5页
以流行性乙型脑炎病毒减弱毒株SA14 14 2的基因组RNA为模板 ,采用RT PCR技术扩增其 NS1基因的cDNA ,将其克隆到 pMD18 T载体中 ,得到克隆质粒pMD18 T NS1。pMD18 T NS1经 EcoRI和SalI酶切后 ,回收NS 1片段克隆到原核表达载体 pET 2 8a(+... 以流行性乙型脑炎病毒减弱毒株SA14 14 2的基因组RNA为模板 ,采用RT PCR技术扩增其 NS1基因的cDNA ,将其克隆到 pMD18 T载体中 ,得到克隆质粒pMD18 T NS1。pMD18 T NS1经 EcoRI和SalI酶切后 ,回收NS 1片段克隆到原核表达载体 pET 2 8a(+) EcoRI/SalI位点 ,构建了重组原核表达质粒 pET 2 8a(+) NS1。转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导获得高效表达 ,产物经SDS PAGE电泳结果显示 ,表达产物分子量约为 45kD。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 ns1基因 反转录-聚合酶链反应 克隆 表达
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鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达 被引量：5
7
作者 王君伟 李勐 +3 位作者 马波 布日额 刘宝全 Ulrich Neumann 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2004年第1期10-13,共4页
本研究根据 Gen Bank发表的 GPV B株全基因核苷酸序列 ,设计了 1对用以扩增 GPV主要非结构蛋白 NS1基因的引物。通过 PCR技术 ,扩增出 NS1完整基因片段 1.9kb。将 PCR产物克隆到 p MD 18- T载体后进行序列测定及分析 ,结果表明 :GPV H1... 本研究根据 Gen Bank发表的 GPV B株全基因核苷酸序列 ,设计了 1对用以扩增 GPV主要非结构蛋白 NS1基因的引物。通过 PCR技术 ,扩增出 NS1完整基因片段 1.9kb。将 PCR产物克隆到 p MD 18- T载体后进行序列测定及分析 ,结果表明 :GPV H1株 NS1基因全长 1884 bp,编码 6 2 7个氨基酸 ,与国外已发表的 B株核苷酸序列同源性为 98.15 %。同时将该目的基因正向插入到 GST融合蛋白原核表达载体 PGEX- 6 P- 1的 Bam H 多克隆位点 ,构建了 GPV NS1的原核表达载体 ,成功的表达了约 97KD的 NS1融合蛋白。 展开更多
关键词 鹅细小病毒 ns1基因 基因克隆 基因表达 原核表达 小鹅瘟
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猪细小病毒NS_1基因的克隆及表达 被引量：4
8
作者 吕建强 陈焕春 +1 位作者 赵俊龙 何启盖 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期435-437,共3页
根据 Bergeron等报道的猪细小病毒基因组序列设计引物 ,在下游引物中引入 Bgl 酶切位点以便于构建表达载体。利用 PCR技术扩增得到 NS1 全基因 ,将其克隆到 p MD18- T载体中进行序列测定并分析 ,进而构建重组转移载体p Fast- NS1 ,在 DH... 根据 Bergeron等报道的猪细小病毒基因组序列设计引物 ,在下游引物中引入 Bgl 酶切位点以便于构建表达载体。利用 PCR技术扩增得到 NS1 全基因 ,将其克隆到 p MD18- T载体中进行序列测定并分析 ,进而构建重组转移载体p Fast- NS1 ,在 DH1 0 Bac大肠杆菌中与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒 (Ac NPV )基因组 (Bacmid)发生同源重组 ,获得重组穿梭载体 Bacmid- NS1 ,经脂质体介导转染 Sf9细胞后 ,得到重组杆状病毒 (Ac NPV- NS1 )。SDS- PAGE、Western-blotting分析可见大小约为 84 0 0 0的特异性带 ,表明 NS1 蛋白在杆状病毒 Bac- To- Bac表达系统中成功地实现了表达 ,从而为研究其结构与功能创造了条件。 展开更多
关键词 猪细小病毒 ns1基因 基因克隆 基因表达 PCR技术
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非结构蛋白NS1-ELISA检测禽流感野毒感染抗体 被引量：6
9
作者 王泽霖 李建丽 +1 位作者 陈少渠 刘守川 《科技导报》 CAS CSCD 2006年第3期14-17,共4页
利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合... 利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在,NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法。最佳包被浓度为2．5μg／ml,血清的最佳稀释倍数为1:200, 酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5 000。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0．225、0．210、0．205和0．184．均为阴性;而对H9N2和H5N2亚型活毒感染10-15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0．610和0．619,均为阳性。因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型．具有A型特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。 展开更多
关键词 AIV H5N2亚型 RT-PCR ns1基因 表达 间接ELISA
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猪细小病毒SD-68株NS1基因的克隆与序列分析 被引量：6
10
作者 刘艳华 范伟兴 +3 位作者 王锡乐 刘文强 许传田 张志 《中国病毒学》 CSCD 2004年第4期353-355,共3页
对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽。该序列与PPVSY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.9%、99.9%... 对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽。该序列与PPVSY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.9%、99.9%、99.7%、98.1%,氨基酸的同源性分别为99.7%、99.5%、99.5%、96.7%。PPVSD-68株与MVM(i)、MEV(Abashiri)、CPV、FPV、BPV3、GPVNS1的进化树分析表明:PPVSD-68株NS1与MVM(i)NS1亲缘关系最近,与BPV3NS1的亲缘关系最远;在Thr435和Ser473位点PPVSD-68株与MVM(i)完全一致,表明Thr435和Ser473是PPVSD-68株NS1潜在的磷酸化位点。 展开更多
关键词 猪细小病毒 PPV ns1基因 克隆 序列分析 母猪繁殖障碍
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猪细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆、序列分析及蛋白质结构预测 被引量：8
11
作者 刘建 汤德元 +6 位作者 罗险峰 曾智勇 李春燕 甘振磊 王凤 郝飞 王洪光 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第5期8-13,共6页
根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株序列,利用Oligo 6.0软件设计1对扩增NS1全基因的特异性引物,对从贵州省安顺地区检测到的PPV的NS1基因进行扩增、克隆、测序、序列分析和蛋白质结构预测分析。测序结果表明,扩增的目的基因... 根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株序列,利用Oligo 6.0软件设计1对扩增NS1全基因的特异性引物,对从贵州省安顺地区检测到的PPV的NS1基因进行扩增、克隆、测序、序列分析和蛋白质结构预测分析。测序结果表明,扩增的目的基因长度为1986bp,共编码659个氨基酸,其中NS1基因的1287、1288和1298位碱基发生了缺失,导致429、430和433位氨基酸发生缺失。系统发生树结果表明,本试验测序的NS1基因与NADL-2弱毒株处在同一进化分支;氨基酸同源性与NADL-2弱毒株和Kresse毒株最高,均为98.6%。蛋白质结构预测分析结果表明,非结构蛋白NS1的分子质量为75269.76u,理论等电点pI为7.25,不稳定系数为41.57,推测其为不稳定蛋白质;脂肪指数为73.58,总体平均亲水性为-0.565,推测该蛋白质是一种亲水性蛋白质;该蛋白质含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,柔性区域较多,呈连续分布;非结构蛋白NS1无跨膜区和信号肽;预测非结构蛋白NS1含有3个N-糖基化位点、3个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、22个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、8个N-肉豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点及1个ATP/GTP结合位点基序A(P-环);该蛋白质抗原表位较多,存在10个主要的抗原表位。 展开更多
关键词 猪细小病毒 ns1基因 克隆 序列分析 蛋白质结构预测
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猪细小病毒NS1基因的原核表达及重组蛋白的复性 被引量：6
12
作者 金喜新 崔保安 +3 位作者 魏战勇 刘占通 王学斌 田永军 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期126-130,共5页
利用PCR技术扩增出PPVNS1基因抗原区。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序。测序结果表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确,通过试验摸索并确定了表达NS1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.... 利用PCR技术扩增出PPVNS1基因抗原区。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序。测序结果表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确,通过试验摸索并确定了表达NS1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为10h,温度为37℃,其表达量占全菌蛋白的29.8%。表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为52kDa的重组蛋白且以包涵体形式存在。重组蛋白经Westernblot检测,结果证明重组蛋白可被PPV阳性血清识别。用8mol/L尿素变性溶解包涵体,再用稀释方法和还原型、氧化型谷胱甘肽系统相结合的方法对重组蛋白进行复性。ELISA检测表明,复性后的重组蛋白有良好的生物活性。 展开更多
关键词 猪细小病毒 ns1基因 原核表达 变性 复性
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猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达 被引量：5
13
作者 谢金文 沈志强 +3 位作者 王金良 任艳玲 管宇 苗立中 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第7期2679-2681,共3页
[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a（＋）多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源... [目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a（＋）多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%-99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。 展开更多
关键词 猪细小病毒 ns1基因 克隆 原核表达
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猪细小病毒(PPV)SC1株非结构蛋白NS_1基因的克隆和序列分析 被引量：7
14
作者 殷华平 郭万柱 +1 位作者 徐志文 罗燕 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期504-508,共5页
本文根据GenBank中PPV NADL-2株病毒基因组序列用Oligo6.0设计了一对引物,以抽提的PPV-SC1 RF-DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.2kb的片段,将其插入克隆载体质粒pMD 18-T的EcoRV酶切位点处,构建了重组质粒pPNS1并测序.密码子偏向性分析结... 本文根据GenBank中PPV NADL-2株病毒基因组序列用Oligo6.0设计了一对引物,以抽提的PPV-SC1 RF-DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.2kb的片段,将其插入克隆载体质粒pMD 18-T的EcoRV酶切位点处,构建了重组质粒pPNS1并测序.密码子偏向性分析结果表明PPV-SC1 NS1基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,主要是以A结尾的密码子;用Bioedit和swiss TMPRED软件预测PPV-SC1 NS1的跨膜区,并没有得到有显著意义的跨膜区的存在;根据基于motif数据库的结构域预测,PPV-SC1 NS1的第393～415位氨基酸残基存在潜在的ATP/GTP结合位点,该蛋白还存在16个蛋白激酶磷酸化位点,21个酪蛋白激酶2磷酸化位点,3个cAMP-/cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点,PPV-SC1 NS1蛋白与POX-D5(痘病毒D5蛋白)具有一致的保守结构域,推测NS1可能与POX-D5有类似的功能. 展开更多
关键词 猪细小病毒 非结构蛋白 ns1基因 生物信息学
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流行性乙型脑炎病毒NS1基因克隆及其蛋白表达纯化 被引量：7
15
作者 张孝忠 刘一凡 +3 位作者 谷思颖 余娜 段彦祥 李有文 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第8期2320-2326,共7页
为了表达流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确... 为了表达流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056bp,以包涵体的形式表达约40ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 流行性乙型脑炎病毒(JEV) ns1基因 克隆 蛋白表达 蛋白纯化
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番鸭细小病毒NS1基因的克隆与原核表达 被引量：7
16
作者 董嘉文 孙敏华 +3 位作者 李林林 袁建丰 邝瑞欢 胡奇林 《中国动物传染病学报》 CAS 2013年第3期33-37,共5页
本研究利用PCR方法扩增番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MPV)非结构蛋白NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-NS1。将其转化受体菌E.coli Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western b... 本研究利用PCR方法扩增番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MPV)非结构蛋白NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-NS1。将其转化受体菌E.coli Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,NS1基因在大肠杆菌中得到了表达,并且可与抗MPV的多克隆抗体发生特异性反应。MPV NS1基因的成功表达为研制MPV的诊断试剂盒、基因工程疫苗等奠定了基础。 展开更多
关键词 番鸭细小病毒 ns1基因 克隆 表达
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猪细小病毒1型河南流行毒株的遗传进化分析 被引量：1
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作者 许夕雅 丁晨梦 +7 位作者 孙亚威 韩紫薇 齐江坤 吕晨哲 石蒙蒙 郭子仪 邓梦梦 陈陆 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2023年第2期288-297,351,共11页
【目的】监测河南省猪细小病毒1型(porcine parvovirus 1,PPV1)的变异情况。【方法】采集自河南省鹤壁市和安阳市初产母猪的流产胎儿阳性样品,利用PCR方法鉴定获得2株PPV1流行毒株,经过全基因组测序,分别命名为CH/HN-H/2021和CH/HN-3/2... 【目的】监测河南省猪细小病毒1型(porcine parvovirus 1,PPV1)的变异情况。【方法】采集自河南省鹤壁市和安阳市初产母猪的流产胎儿阳性样品,利用PCR方法鉴定获得2株PPV1流行毒株,经过全基因组测序,分别命名为CH/HN-H/2021和CH/HN-3/2021。通过分析同源性和构建遗传进化树分析PPV1全基因组、NS1基因、VP2基因的变异情况,并且比对分析NS1蛋白和VP2蛋白的氨基酸变异情况及非编码区基因缺失情况。【结果】2条序列的核苷酸相似性为99.9%;与46株国内外PPV1流行毒株全基因组的核苷酸同源性为93.5%~99.9%;NS1基因核苷酸同源性为98.6%~99.9%,NS1蛋白氨基酸同源性为98.2%~99.9%;VP2基因核苷酸同源性为98.4%~99.9%,VP2蛋白氨基酸同源性为98.3%~99.9%,说明本研究鉴定的毒株呈现遗传进化稳定性。本研究鉴定株与湖南及吉林毒株亲缘关系最近,而与河南原有毒株亲缘关系较远。在对NS1蛋白与VP2蛋白的氨基酸变异分析中发现,NS1蛋白发生6处突变,VP2蛋白发生7处突变,均在经典突变位点范围内,符合PPV1遗传变异的保守性。鉴定株VP2基因后部非编码区基因与NADL-2株相比缺失127 nt。【结论】本研究鉴定的毒株呈现遗传进化稳定性,河南省存在新旧PPV1毒株同时流行的情况。 展开更多
关键词 猪细小病毒1型 全基因组测序 遗传变异分析 ns1基因 VP2基因
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水貂肠炎病毒B株全基因克隆与序列分析 被引量：6
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作者 陈涛 赵建军 +3 位作者 张海玲 吴威 钱爱东 闫喜军 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期81-85,共5页
将水貂肠炎病毒基因组分4个重叠片段进行PCR扩增,并将产物克隆到pMD18-T载体中,测定基因组近全长序列。其中编码水貂肠炎病毒非结构蛋白基因(NS1基因)全长为2 007 bp,编码668个氨基酸;编码结构蛋白基因(VP2基因)全长为1 755 bp,编码584... 将水貂肠炎病毒基因组分4个重叠片段进行PCR扩增,并将产物克隆到pMD18-T载体中,测定基因组近全长序列。其中编码水貂肠炎病毒非结构蛋白基因(NS1基因)全长为2 007 bp,编码668个氨基酸;编码结构蛋白基因(VP2基因)全长为1 755 bp,编码584个氨基酸。序列分析结果表明:水貂肠炎病毒B株与犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒NS1序列之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.8%～99.2%和98.8%～99.2%,与其他细小病毒毒株VP2序列之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.5%～99.8%和97.8%～99.5%,与MEVantigenic type 2株在亲缘上有着最密切关系。 展开更多
关键词 水貂肠炎病毒 ns1基因 VP2基因 序列分析
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14株北京地区犬细小病毒分离毒株的VP2、NS1基因序列分析 被引量：5
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作者 李少晗 由欣月 +4 位作者 范君文 徐一 郝雲峰 崔尚金 秦彤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期262-267,共6页
从北京地区疑似细小病毒感染的犬粪拭子中成功分离鉴定出14株犬细小病毒(CPV)毒株,并对其完整的VP2和NS1基因进行了序列分析。结果表明,鉴定到的14株CPV毒株中,7株为New CPV-2a型,7株为CPV-2c型。此外,NS1的19、33、293、588、624和656... 从北京地区疑似细小病毒感染的犬粪拭子中成功分离鉴定出14株犬细小病毒(CPV)毒株,并对其完整的VP2和NS1基因进行了序列分析。结果表明,鉴定到的14株CPV毒株中,7株为New CPV-2a型,7株为CPV-2c型。此外,NS1的19、33、293、588、624和656位氨基酸以及VP2的13、574位氨基酸为新鉴定的氨基酸突变位点。基于VP2、NS1基因的系统进化分析表明,大部分的New CPV-2a型和CPV-2c型毒株与广西南宁和吉林长春地区的分离毒株亲缘关系密切,说明本次分离毒株与广西或吉林地区分离毒株具有相同的起源。本研究为更好地开展犬细小病毒流行病学调查提供了有益借鉴,也为深入研究犬细小病毒变异和传播的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 犬细小病毒 分离鉴定 VP2基因 ns1基因 进化分析
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猪细小病毒NS1基因和VP2基因的克隆与序列分析 被引量：5
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作者 邱莹 胡传伟 +5 位作者 朱晓林 谢之景 赵宏坤 姜世金 张兴晓 陈甜甜 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第5期1460-1464,共5页
根据GeneBank上发表的猪细小病毒（PPV）的基因组序列,分别设计扩增非结构蛋白NS1基因和结构蛋白VP2基因的特异性引物,采用PCR方法扩增PPV泰安株（PPV-TA）NS1基因和VP2基因。结果表明,PPV-TANS1基因长1989 bp,编码662个氨基酸,与参考PP... 根据GeneBank上发表的猪细小病毒（PPV）的基因组序列,分别设计扩增非结构蛋白NS1基因和结构蛋白VP2基因的特异性引物,采用PCR方法扩增PPV泰安株（PPV-TA）NS1基因和VP2基因。结果表明,PPV-TANS1基因长1989 bp,编码662个氨基酸,与参考PPVNS1基因核苷酸同源性在98.3%～99.9%之间。PPV-TA NS1蛋白有3个糖基化位点分别是356NIS、446NFS、513NLT,除PPV Tomau/1/02在356位缺失了一个糖基化位点之外,PPV-TA与其他PPV参考毒株一致;这表明不同毒株NS1蛋白调节功能可能有差异。PPV-TA NS1蛋白的潜在磷酸化位点是Thr435和Ser473,与PPV参考毒株相同。NS1基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV china亲缘关系最近。PPV-TAVP2基因长1740 bp,编码579个氨基酸,与PPV参考毒株VP2基因核苷酸同源性在98.3%～99.8%之间。PPV-TA VP2蛋白的378D、383H、436S氨基酸残基决定了PPV的组织嗜性,与PPV-NADL-2和PPV-china相同,这表明这3个毒株的组织嗜性是一致的。但与其他PPV参考毒株有差异,这表明不同毒株在动物体内的组织分布是有差别的。PPV-TA VP2蛋白有9个线性抗原位点,与PPV NADL-2和PPV china的线性抗原位点是一致的,这表明具有相同的抗原特性。VP2基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV NADL-2亲缘关系较近。 展开更多
关键词 猪细小病毒 ns1基因 VP2基因
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