构建蜕皮激素受体(Ecdysteroid receptor,EcR)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)的表达载体,使两者在大肠杆菌内高效共表达,获得具有活性的目的蛋白,即EcR和USP的复合蛋白(EcR-USP)。将N端带有6×His tag的EcR目的基因片段克隆于p ET...构建蜕皮激素受体(Ecdysteroid receptor,EcR)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)的表达载体,使两者在大肠杆菌内高效共表达,获得具有活性的目的蛋白,即EcR和USP的复合蛋白(EcR-USP)。将N端带有6×His tag的EcR目的基因片段克隆于p ET21b MDX12(+)载体内,将N端带有6×His tag的USP目的基因片段克隆于p ET28a(+)载体内,并将两个重组质粒同时转化入同一宿主菌BL21(DE3)内利用IPTG低温诱导双基因共表达,选用"超声破碎法"提取共表达蛋白,色谱柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot分析纯化结果,Micro Cal i TC200法与小分子化合物20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)相互作用进行活性分析。SDS-PAGE与Western Blot分析结果显示宿主菌中表达产物存在蛋白复合体,大小与预期相符,Micro Cal i TC200实验显示EcR-USP与20E有结合,即EcR-USP有活性。得到有活性的家蚕的EcR-USP的可溶性表达产物,为进一步对其进行结构与功能的研究奠定了基础。展开更多
文摘构建蜕皮激素受体(Ecdysteroid receptor,EcR)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)的表达载体,使两者在大肠杆菌内高效共表达,获得具有活性的目的蛋白,即EcR和USP的复合蛋白(EcR-USP)。将N端带有6×His tag的EcR目的基因片段克隆于p ET21b MDX12(+)载体内,将N端带有6×His tag的USP目的基因片段克隆于p ET28a(+)载体内,并将两个重组质粒同时转化入同一宿主菌BL21(DE3)内利用IPTG低温诱导双基因共表达,选用"超声破碎法"提取共表达蛋白,色谱柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot分析纯化结果,Micro Cal i TC200法与小分子化合物20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)相互作用进行活性分析。SDS-PAGE与Western Blot分析结果显示宿主菌中表达产物存在蛋白复合体,大小与预期相符,Micro Cal i TC200实验显示EcR-USP与20E有结合,即EcR-USP有活性。得到有活性的家蚕的EcR-USP的可溶性表达产物,为进一步对其进行结构与功能的研究奠定了基础。
