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罗氏沼虾诺达病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:6
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作者 童桂香 黎小正 +3 位作者 卢小花 廖永志 江林源 韦信贤 《上海海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期54-59,共6页
罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设... 罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测MrNV的灵敏度大约为RT-PCR的103倍,最低可检测到2.612×10-2 fg MrNV RNA。应用套式RT-PCR和一步法RT-PCR同时对108份来自广西各地的罗氏沼虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有9份检出MrNV,而一步法RT-PCR仅有3份检出MrNV。由此可见,建立的套式RT-PCR检测方法具有极高的特异性和敏感性,能提高MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断,为WTD的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供可靠的技术手段。研究亮点:根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,优化建立了检测MrNV的套式RT-PCR方法。该方法具有极高的特异性和敏感性,最低可检测到2.612×10-2fg MrNV RNA,能提高临床样品MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断。 展开更多
关键词 罗氏沼虾诺达病毒 白尾病 衣壳蛋白基因 套式RT-PCR 快速检测
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Development of Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Assay for Detection of Macrobrachium rosenbergii Nodavirus 被引量:2
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作者 Feng LIN Li LIU +5 位作者 Dong QIAN Guijie HAO Pengcheng SHENG Zheng CAO Xuemei YUAN Jinyu SHEN 《Agricultural Biotechnology》 CAS 2014年第3期42-45,共4页
A nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)assay was established for the detection of Macrobrachium rosenbergii Nodavirus(MrNV).The specific primers were designed according to the high conserved region of R... A nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)assay was established for the detection of Macrobrachium rosenbergii Nodavirus(MrNV).The specific primers were designed according to the high conserved region of RNA2 sequence of MrNV.The 224 bp specific amplification product was obtained in positive sample determined with 3%agarose gel electrophoresis,while no product was generated from shrimp infected with other viruses including DNA viruses(IHHNV,WSSV)and RNA viruses(TSV,IMNV,YHV).The detecting limit of the assay was 8pg nucleic acid,which is more sensitive than that of PCR method. 展开更多
关键词 macrobrachium rosenbergii nodavirus Nucleic acid sequence-based amplification DETECTION
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罗氏沼虾野田村病毒中国株RT-LAMP-LFD快速检测方法的研究 被引量:1
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作者 林锋 刘莉 +4 位作者 郝贵杰 曹铮 盛鹏程 吴颖蕾 沈锦玉 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期502-507,共6页
罗氏沼虾白尾病(White tail disease,WTD)是流行于罗氏沼虾苗种阶段的重要疾病,该病病原被确定为罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV),为了建立罗氏沼虾野田村病毒中国分离株(MrNV-chin)的便捷、灵敏、特异... 罗氏沼虾白尾病(White tail disease,WTD)是流行于罗氏沼虾苗种阶段的重要疾病,该病病原被确定为罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV),为了建立罗氏沼虾野田村病毒中国分离株(MrNV-chin)的便捷、灵敏、特异的分子诊断方法,本研究根据罗氏沼虾野田村病毒RNA2基因保守序列的6个区域设计了4条特异性引物和1条检测探针,将环介导等温扩增技术与侧向流层析试纸(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了MrNV的RT-LAMP-LFD检测方法。结果表明,该方法的灵敏度是常规琼脂糖凝胶电泳的10倍;从核酸提取到检测结果判定仅需45min;反应特异性强,对其他虾类病毒WSSV、IHHNV、IMNV、TSV和YHV扩增结果均为阴性;操作简单,不需要复杂的仪器,在61℃水浴反应即可;利用LFD试纸显示结果,肉眼可直接观察判定。作为一种快速灵敏实用的分子诊断技术,该方法有利于罗氏沼虾白尾病的诊断与预防。 展开更多
关键词 罗氏沼虾野田村病毒 环介导等温扩增技术 侧向流层析试纸
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罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备及应用 被引量:9
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作者 刘问 钱冬 +1 位作者 吴建翔 邵健忠 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期529-533,共5页
罗氏沼虾肌肉白浊病(whitish muscle disease of Macrobrachium rosenbergii)是一种发生在罗氏沼虾苗种阶段的流行病,发病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,死亡率高达60%以上。作者所在实验室在确定其病原是罗氏沼虾诺达病毒(Macrobra... 罗氏沼虾肌肉白浊病(whitish muscle disease of Macrobrachium rosenbergii)是一种发生在罗氏沼虾苗种阶段的流行病,发病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,死亡率高达60%以上。作者所在实验室在确定其病原是罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV)的基础上,用MrNV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,得到12株能特异分泌抗MrNV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞。注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶105~106。亚型鉴定结果表明,有6株单抗为IgG1型,4株单抗为IgG2a型,2株单抗为IgG2b型。12株单抗与对虾白斑综合征病毒(WSSV)和桃拉综合征病毒(TSV)均无交叉反应。挑选效价高的腹水单抗2B5,建立了检测罗氏沼虾诺达病毒的三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)法,该方法检测灵敏度达0.98ng左右。Wesrternblot分析表明,2B5能与MrNV43kD的外膜蛋白特异性结合。 展开更多
关键词 罗氏沼虾 肌肉白浊病 罗氏沼虾诺达病毒 单克隆抗体 三抗体夹心酶联免疫吸附测定
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罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量:1
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作者 黄玉英 杨明伟 +5 位作者 谭红连 梁正 曾兰 韦信贤 黄光华 童桂香 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1474-1482,共9页
【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)和十足目虹彩病毒1(DIV1)的二重荧光定量PCR,为罗氏沼虾白尾病(WTD)及虹彩病毒病(DIV1D)的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因... 【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)和十足目虹彩病毒1(DIV1)的二重荧光定量PCR,为罗氏沼虾白尾病(WTD)及虹彩病毒病(DIV1D)的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段分别克隆至pGM-T载体上制备重组质粒(pGM-T-CP^(MrNV)和pGM-T-MCP^(DIV1)),其中,pGM-T-CP^(MrNV)用Sal I酶切后经体外转录获得MrNV标准品RNA,pGM-T-MCP^(DIV1)则直接作为DIV1标准品DNA;以标准品为模板进行反应条件优化及标准曲线制定,建立可同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA均具有很好的稳定性,可作为标准品和阳性对照使用;标准品起始模板范围为1.0×10^(1)~1.0×10^(8)Copies/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的二重荧光定量PCR灵敏度高,对标准品的检测灵敏度可达10 Copies/反应,对罗氏沼虾组织样品的检测灵敏度约10 Copies/mg;与其他虾类常见病原无交叉反应,且整个检测过程仅需1 h左右。二重荧光定量PCR检测MrNV的组内试验和组间试验变异系数分别为0.31%~0.93%和0.96%~1.33%,检测DIV1的组内试验和组间试验变异系数分别为0.35%~0.81%和0.78%~1.04%。应用建立的二重荧光定量PCR和国内现行有效标准的套式PCR分别对117份临床样品进行MrNV和DIV1检测,结果显示对MrNV和DIV1检测的符合率分别为99.15%和97.44%,且二重荧光定量PCR检测目标病毒拷贝数较低样品时较套式PCR具有更高的灵敏度。2020年广西罗氏沼虾样品MrNV和DIV1的阳性检出率分别为6.0%和11.0%。【结论】结合TaqMan-MGB探针技术建立的二重荧光定量PCR能同时检测MrNV和DIV1,且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点,可为WTD和DIV1D的 展开更多
关键词 罗氏沼虾野田村病毒(MrNV) 十足目虹彩病毒1(DIV1) TAQMAN-MGB探针 二重荧光定量PCR
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