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牛分枝杆菌mpb51-mpb70融合基因的原核表达与抗原活性初步鉴定 被引量:2
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作者 姜秀云 周步丹 +6 位作者 董阳 包艳红 陈敬蕊 刘磊 王春芳 徐博文 马红霞 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期805-810,共6页
目的通过获得牛分枝杆菌保护性抗原MPB51、MPB70的融合蛋白MPB51-MPB70,以提高单一蛋白的抗原性。方法采用重叠拼接PCR技术将牛分枝杆菌mpb51与mpb70基因融合,获得融合基因mpb51-mpb70,克隆至pMD19中,构建重组质粒pMD-51-70。酶切、纯... 目的通过获得牛分枝杆菌保护性抗原MPB51、MPB70的融合蛋白MPB51-MPB70,以提高单一蛋白的抗原性。方法采用重叠拼接PCR技术将牛分枝杆菌mpb51与mpb70基因融合,获得融合基因mpb51-mpb70,克隆至pMD19中,构建重组质粒pMD-51-70。酶切、纯化后连接至pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET-51-70。通过SDS-PAGE和Western blotting分析、鉴定融合蛋白的表达及抗原性。以间接ELISA比较MPB51、MPB70、MPB51-MPB70的抗原性。结果表达、纯化了45ku的融合蛋白MPB51-MPB70,并与牛结核血清发生特异性反应,且比单一蛋白反应性强。结论成功地获得了具有良好抗原性的牛分枝杆菌融合蛋白MPB51-MPB70。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 mpb51基因 mpb70基因 融合蛋白
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牛型结核分枝杆菌分泌性蛋白MPB70.MPB83基因串联重组质粒的构建及鉴定
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作者 叶俊 布日额 +3 位作者 陈金龙 吴金花 锡林高娃 王金良 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第12期1429-1432,共4页
目的构建牛型结核分枝杆菌(MB)分泌性蛋白mpb70.mpb83基因串联重组表达质粒,为进--步利用工程菌表达、获得相应抗原蛋白奠定实验基础。方法参考NCBI上公布的MB全基因组序列(EU683972.1),在利用DNAstar7.0生物信息软件分析分泌性蛋白mpb7... 目的构建牛型结核分枝杆菌(MB)分泌性蛋白mpb70.mpb83基因串联重组表达质粒,为进--步利用工程菌表达、获得相应抗原蛋白奠定实验基础。方法参考NCBI上公布的MB全基因组序列(EU683972.1),在利用DNAstar7.0生物信息软件分析分泌性蛋白mpb70、mpb83抗原性基础上,选择mpb70、mpb83基因编码多肽主要抗原域,利用重叠延伸PCR技术构建pGEX-6p-mpb70+mpb83串联重组表达质粒。结果生物信息学预测MPB70、MPB83基因的抗原域分别在30-171位氨基酸和20-190位氨基酸。在mpb70、mpb83间加入16位柔性多肽序列,在线分析不影响mpb70和mpb83融合后的抗原性。pGEX-6p-1-mpb70+mpb83经双酶切获得966bp和4966bp两条片段,与预期一致;测序表明mpb70+mpb83融合基因无碱基突变和缺失,重组质粒构建正确。结论确定了MB早期标识性分泌性蛋白mpb70、mpb83基因的抗原域,获得了mpb70、mpb83串联基因,构建的重组原核表达载体柔性多肽的引人确保mpb70和mpb83的天然抗原构象且不影响融合蛋白的抗原性,为重组抗原的表达,单克隆抗体制备以及建立MB分泌性蛋白标识物的快速检测试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 mpb70基因 mpb83基因 串联表达
原文传递
牛结核杆菌MPB70-ESAT-6融合蛋白的原核表达及抗原反应性分析 被引量:1
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作者 姜秀云 董阳 +5 位作者 包艳红 张建宁 方诗文 金海玲 王宁 马红霞 《中国兽药杂志》 2019年第3期7-12,共6页
为增强单个蛋白的抗原性,利用(Gly4Ser)3柔性连接肽将牛结核杆菌MPB70和ESAT-6融合。采用重叠延伸PCR技术将牛结核杆菌mpb70与esat-6基因连接,获得融合基因mpb70-esat-6,连接至T-Vector pMD19中,获得克隆质粒pMD-70-esat-6。经Bam HⅠ、... 为增强单个蛋白的抗原性,利用(Gly4Ser)3柔性连接肽将牛结核杆菌MPB70和ESAT-6融合。采用重叠延伸PCR技术将牛结核杆菌mpb70与esat-6基因连接,获得融合基因mpb70-esat-6,连接至T-Vector pMD19中,获得克隆质粒pMD-70-esat-6。经Bam HⅠ、EcoRⅠ酶切、纯化,并与p ET28a(+)载体连接,构建了pET-70-esat-6重组表达质粒。SDS-PAGE发现,在27.2 ku处表达了融合蛋白MPB70-ESAT-6,Western blotting证实,MPB70-ESAT-6与牛结核阳性血清反应性良好。MPB70-ESAT-6融合蛋白的研究为牛结核病诊断抗原及相关疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 牛结核杆菌 mpb70基因 esat-6基因 融合蛋白 原核表达
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牛结核分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量:1
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作者 王志刚 神翠翠 +3 位作者 彭金山 黄瑛 尹晓敏 赵德明 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2010年第5期3-5,共3页
以牛分枝杆菌DNA为模板,克隆了牛分枝杆菌MPB70基因,构建了克隆载体pGEM-MPB70和表达载体pET30a-MPB70,经IPTG诱导在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明,牛分枝杆菌MPB70基因体外扩增... 以牛分枝杆菌DNA为模板,克隆了牛分枝杆菌MPB70基因,构建了克隆载体pGEM-MPB70和表达载体pET30a-MPB70,经IPTG诱导在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明,牛分枝杆菌MPB70基因体外扩增产物与预期值相符,约582 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB70经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为29 kD,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达85%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 mpb70基因 克隆 原核表达 免疫印迹 蛋白纯化
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牛分枝杆菌广西分离株MPB70基因的克隆及序列分析
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作者 谢志勤 谢芝勋 +2 位作者 刘加波 黄小武 张振荣 《中国奶牛》 2010年第11期1-4,共4页
利用牛分枝杆菌MPB70基因特异性引物,以2株牛分枝杆菌广西分离株的染色体DNA为模板,扩增MPB70基因,产物经纯化后与载体PMD18-T连接,然后转化至大肠杆菌DH5α。提取转染后大肠杆菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测... 利用牛分枝杆菌MPB70基因特异性引物,以2株牛分枝杆菌广西分离株的染色体DNA为模板,扩增MPB70基因,产物经纯化后与载体PMD18-T连接,然后转化至大肠杆菌DH5α。提取转染后大肠杆菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNAstar MegAlign对MPB70基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的8株牛分枝杆菌的MPB70基因参考序列进行比较。结果显示广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列比较,其核苷酸序列和氨基酸同源性在77.4%~95.9%之间。这一结果表明广西奶水牛分枝杆菌分离株与参考的其他牛分枝杆菌毒株的MPB70基因没有太大的差异,说明牛分枝杆菌分泌蛋白MPB70基因十分保守,从而为检测跟踪毒株的变异,研制牛分枝杆菌亚单位疫苗提供基础。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 mpb70基因 PCR 序列分析
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