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食品中3种致病李氏菌MPCR-DHPLC检测方法的建立 被引量：10
1
作者 王耀 曹际娟 +1 位作者 闫平平 曹远银 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第8期158-162,共5页
应用复合PCR(multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的快速高通量检测方法。根据单核细胞增生李斯特... 应用复合PCR(multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的快速高通量检测方法。根据单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的特异基因序列分别设计引物,MPCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以94株参考菌株做特异性实验,并开展了重现性检测实验。MPCR-DHPLC方法同步检测到单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的特异性阳性吸收峰,未检测到李斯特菌属其他近源种和非近源种参考菌株的阳性吸收峰,且重现性良好。该方法具有很好的特异性,可以快速、准确、高通量地检测食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌,是食品微生物快速检测的新技术。 展开更多
关键词 复合PCR-变性高效液相色谱法(MPCR-DHPLC) 单核细胞增生李斯特菌 绵羊李斯特菌 英诺克李斯特菌 检测
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基于高分辨率溶解曲线分析鉴别食品中的3种李斯特氏菌 被引量：4
2
作者 岳苑 周梦诗 +5 位作者 徐娟 李睿 何利华 赵飞 张建中 龚杰 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2020年第6期285-290,171,共7页
本研究利用高分辨率熔解曲线的方法,以iap基因为靶标新设计一对引物同时鉴别单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌,其余14种常见食源性病原微生物扩增为阴性结果,单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌的检出限为10个拷贝,英诺... 本研究利用高分辨率熔解曲线的方法,以iap基因为靶标新设计一对引物同时鉴别单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌,其余14种常见食源性病原微生物扩增为阴性结果,单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌的检出限为10个拷贝,英诺克李斯特氏菌的检测限为50个拷贝。本研究对78份样品进行HRM-realtimePCR法、GB4789.30-2016和SN/T1870-2016(荧光PCR法)的检测,并对3种方法的检测结果进行统计学分析。结果显示:HRM法和国标方法、HRM法和荧光PCR法的检测结果之间存在统计学差异,国标方法和荧光PCR法检测结果之间无统计学差异。本研究建立的基于HRM-real time PCR法检测3种李斯特氏菌的方法快速高效、特异性好、成本低,适用于食品中李斯特氏菌的日常检测和监管。 展开更多
关键词 高分辨率熔解曲线 单核细胞增生李斯特氏菌 伊氏李斯特氏菌 英诺克李斯特氏菌 食品
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多交叉置换扩增结合纳米生物传感器检测伊氏李斯特菌的方法建立
3
作者 李慧 王毅 +1 位作者 王艳 叶长芸 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期605-612,共8页
目的应用多交叉置换扩增技术结合纳米生物传感器(multiple cross displacement amplification coupled with gold nanoparticle-based lateral flow biosensor,MCDA-LFB)建立一种快速、特异和灵敏的伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,L.iv... 目的应用多交叉置换扩增技术结合纳米生物传感器(multiple cross displacement amplification coupled with gold nanoparticle-based lateral flow biosensor,MCDA-LFB)建立一种快速、特异和灵敏的伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,L.ivanovii)检测方法,并对该方法进行评价。方法以L.ivanovii种特异性基因smcl为靶标设计引物,对引物进行最佳反应温度、灵敏度和特异性测试,并用模拟样本和实际样本进行评估。结果L.ivanovii-MCDA-LFB的最佳反应温度为64℃。在L.ivanovii和non-L.ivanovii菌种鉴定中,该方法特异性为100%。此外,L.ivanovii-MCDA-LFB在纯培养物和模拟污染粪便样本的灵敏度分别为10 fg/反应和6.8×10^(2) CFU/g。在195份野鼠粪便样本增菌培养物检测中,L.ivanovii-MCDA-LFB检测结果和传统培养法(ISO 11290-1)结果相同,且只需二次增菌液水煮模板即可检出。结论L.ivanovii-MCDA-LFB方法作为一种快速、灵敏和特异的诊断方法可应用于食品、医疗和科研领域。 展开更多
关键词 伊氏李斯特菌 多交叉置换扩增 纳米生物传感器 smcl基因 最低检测限
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模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法 被引量：3
4
作者 许华青 王艳 +3 位作者 王毅 代航 王和 叶长芸 《疾病监测》 CAS 2014年第3期228-233,共6页
目的建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,... 目的建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR。利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。结果采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应。模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103cfu/g和2.92×103cfu/g;模拟粪便标本在3 h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果。结论本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重realtime PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。 展开更多
关键词 单增李斯特菌 伊氏李斯特菌 TaqMan双重real—time PCR 模拟粪便标本
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单核细胞增生性李斯特菌与伊万诺夫李斯特菌菌体蛋白的比较蛋白质组学研究 被引量：1
5
作者 殷月兰 张晨菊 +3 位作者 叶舒扬 潘志明 陈祥 焦新安 《中国家禽》 北大核心 2013年第24期16-19,共4页
李斯特菌属7个种中只有单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogens,LM)和伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii,LI)具有致病性。本研究对LM和LI的菌体蛋白比较蛋白质组学进行了初步研究。通过质谱鉴定,得到12个差异蛋白,功能涉及糖... 李斯特菌属7个种中只有单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogens,LM)和伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii,LI)具有致病性。本研究对LM和LI的菌体蛋白比较蛋白质组学进行了初步研究。通过质谱鉴定,得到12个差异蛋白,功能涉及糖代谢、能量代谢、细胞周期控制以及宿主侵袭、分子伴侣等功能,为深入解析致病性李斯特菌的种间差异和遗传进化奠定了基础。 展开更多
关键词 蛋白组学 菌体蛋白 单核细胞增生性李斯特菌 伊万诺夫李斯特菌
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ILO与LLO协助李斯特菌黏附、侵袭细胞及胞内增殖的比较研究 被引量：1
6
作者 刘思静 刘婷 +3 位作者 周玉真 郭妮 黄欢 汪川 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期152-156,共5页
目的研究李斯特菌溶血素的主要功能,比较两种李斯特菌——绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii, LI)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)的溶血素对细菌黏附细胞等作用的强弱。方法构建含有LI i-hly基因上、下游同源序列和lacZ基因... 目的研究李斯特菌溶血素的主要功能,比较两种李斯特菌——绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii, LI)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)的溶血素对细菌黏附细胞等作用的强弱。方法构建含有LI i-hly基因上、下游同源序列和lacZ基因或hly基因的打靶质粒,利用基因重组技术构建LI溶血素(ILO)缺陷的LI重组菌株LIΔi-hly∷lacZ和回补表达LM溶血素(LLO)的重组菌株LIΔi-hly∷hly;比较2株重组菌与野生LI对人肝癌HepG2细胞的黏附、侵袭能力;比较3株菌在巨噬细胞RAW264.7内的增殖能力。结果重组菌株LIΔi-hly∷lacZ和LIΔi-hly∷hly的基因序列与预期相符;LIΔi-hly∷hly、LI和LIΔi-hly∷lacZ对HepG2细胞的黏附率分别为(3.43±0.82)%、(3.43±1.59)%和(3.41±1.12)%,侵袭率分别为(1.74±0.46)%、(1.22±0.75)%和(1.39±0.46)%,差异均无统计学意义;胞内增殖实验结果表明,与野生株相比,ILO缺陷株LIΔi-hly∷lacZ在巨噬细胞内的增殖量降低,LIΔi-hly∷hly的增殖量升高。结论 LI在细胞内的增殖水平与ILO有关,ILO缺失抑制了LI在细胞内的增殖能力,LM溶血素LLO协助细菌逃离吞噬泡进入宿主细胞质的能力强于LI溶血素ILO。 展开更多
关键词 绵羊李斯特菌 单增李斯特菌 LM溶血素 LI溶血素 胞内增殖
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绵羊李斯特菌为载体的结核多阶段T细胞表位疫苗的构建及评价 被引量：1
7
作者 刘婷 刘思静 +2 位作者 周玉真 张云雯 汪川 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期1-6,共6页
目的构建以绵羊李斯特菌(Listerria ivanovii,LI)为载体的表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)特征性抗原蛋白的疫苗候选菌株,并评价其生物安全性和免疫效果。方法将MTB早期感染、潜伏感染和复发阶段的4种抗原基因的细胞... 目的构建以绵羊李斯特菌(Listerria ivanovii,LI)为载体的表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)特征性抗原蛋白的疫苗候选菌株,并评价其生物安全性和免疫效果。方法将MTB早期感染、潜伏感染和复发阶段的4种抗原基因的细胞表位串联形成融合抗原基因,即多阶段结核杆菌抗原基因,命名为msv。将msv插入含有LI同源序列的打靶质粒,利用同源重组技术构建基因组整合msv抗原基因的重组LI菌株。观察重组菌株的体外生长情况,通过Western blot验证靶抗原蛋白的表达情况,测定重组菌株对C57BL/6小鼠的半数致死量(50%lethal dose,LD50),以0.1×LD50为免疫剂量,通过尾静脉接种小鼠,通过接种前及接种后1、2、3、5、7、14 d的血清谷丙转氨酶(ALT)水平、脏器载菌量和脏器病理切片评价疫苗候选株的安全性。为测定疫苗候选株的免疫效果,另取3组小鼠分别尾静脉免疫LI-msv、LI、NS,免疫后第9天制备脾悬液,流式细胞术检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)等细胞因子的CD4+T细胞和CD8+T细胞水平结果成功构建能表达多阶段结核杆菌抗原的疫苗候选株LI-msv。LI-msv对C57BL/6小鼠的LD50为3.3×10^8 CFU/只。通过尾静脉接种小鼠后,LI-msv主要在小鼠肝脏和脾脏内短期繁殖,7d后能被机体清除,对肝、脾的病理损伤时间短且可恢复;流式细胞术检测结果表明接种LI-msv的小鼠脾淋巴细胞分化出了特异的IFN-γ^+CD4^+T细胞和IFN-γ^+CD8^+T细胞,阳性细胞比率较相应载体对照组和生理盐水对照组高(P<0.005);特异性TNF-α^+CD4^+T细胞比率高于相应载体对照组(P<0.01)和生理盐水对照组(P<0.005),TNF-α^+CD8^+T细胞比率高于生理盐水对照组(P<0.005)结论成功构建了一株以LI为载体的表达结核杆菌多阶段抗原的疫苗候选株。该菌株具有生物安全性,且能诱导一定的特异性细胞免疫应答,有望作为结核疫苗� 展开更多
关键词 结核病 多阶段结核疫苗 绵羊李斯特菌 安全性 免疫效果
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奶牛粪便分离的伊氏李斯特菌伊氏亚种基因组序列测定及其分子特征分析 被引量：1
8
作者 蒋华英 甘霖 +8 位作者 毛盼 宋泽萱 纪顺师 王怡倩 王艳 徐保红 高伟利 陈峥宏 叶长芸 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期624-630,共7页
目的了解某奶牛场奶牛粪便中李斯特菌的携带情况及其分离株的遗传特征。方法用ISO 11290方法分离196份奶牛粪便样本中的李斯特菌,对分离的伊氏李斯特菌进行全基因测序,用MEGA6.0构建系统发育树,网站在线比对分析伊氏李斯特菌株的毒力基... 目的了解某奶牛场奶牛粪便中李斯特菌的携带情况及其分离株的遗传特征。方法用ISO 11290方法分离196份奶牛粪便样本中的李斯特菌,对分离的伊氏李斯特菌进行全基因测序,用MEGA6.0构建系统发育树,网站在线比对分析伊氏李斯特菌株的毒力基因、耐药基因及前噬菌体等。结果196份奶牛场养殖的奶牛粪便样本中有9份样本为李斯特菌阳性,其中3株为伊氏李斯特菌伊氏亚种,6株为英诺克李斯特菌,分离率分别为1.53%和3.06%。3株伊氏李斯特菌伊氏亚种分离株具有包括LIPI-1和LIPI-2在内的绝大部分致病性李斯特菌毒力相关基因,携带一个不完整的前噬菌体及22个耐药相关基因。结论养殖场奶牛粪便中携带伊氏李斯特菌伊氏亚种。对伊氏李斯特菌伊氏亚种分离株的全基因组、毒力基因、耐药基因、前噬菌体基因等遗传特征分析,为进一步分析其致病性提供了参考。 展开更多
关键词 伊氏李斯特菌伊氏亚种 毒力基因 耐药基因 前噬菌体基因
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表达绿色荧光蛋白的重组绵羊李斯特菌的构建及荧光分析
9
作者 张祥 苏琳 +4 位作者 刘思静 李泳榆 蒋明娟 黄欢 汪川 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期809-813,共5页
目的构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组绵羊李斯特菌,为绵羊李斯特菌的研究提供重要工具。方法利用SOEing PCR的方法将单核细胞增生性李斯特菌溶血素的启动子(phly)与GFP基因融合,连接到pCW质粒上,构建重组原核表达质粒pCW-phly-GFP。将... 目的构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组绵羊李斯特菌,为绵羊李斯特菌的研究提供重要工具。方法利用SOEing PCR的方法将单核细胞增生性李斯特菌溶血素的启动子(phly)与GFP基因融合,连接到pCW质粒上,构建重组原核表达质粒pCW-phly-GFP。将重组质粒电转化绵羊李斯特菌,利用荧光显微镜分析荧光表达情况。分别在含红霉素和不含红霉素的BHI肉汤中连续传代培养携带重组质粒的绵羊李斯特菌,通过提取质粒和观察荧光的方法研究重组质粒pCW-phly-GFP及GFP在绵羊李斯特菌中的稳定性。结果重组质粒pCW-phly-GFP酶切验证和测序均正确。在荧光显微镜下可以见到携带重组质粒的绵羊李斯特菌发绿色荧光。在红霉素抗性压力选择下重组质粒pCW-phly-GFP能稳定存在于绵羊李斯特菌中,并高效表达GFP。结论成功构建了GFP基因原核表达质粒pCW-phly-GFP,能在绵羊李斯特菌中高效表达GFP,为进一步研究绵羊李斯特菌作为疫苗载体提供了重要的工具。 展开更多
关键词 绵羊李斯特菌 绿色荧光蛋白 原核表达
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绵羊李斯特菌载体结核疫苗株inlB1基因缺失减毒株的构建及评价
10
作者 黄嘉玲 刘思静 +1 位作者 苏琳 汪川 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期814-818,共5页
目的对以绵羊李斯特菌(Listeriaivanovii,LI)为载体的结核疫苗候选株LI-Ag85C进行基因减毒,初步评价其体内外生物学特性。方法构建含有inlB1基因上、下游同源序列的打靶质粒,电转原始菌LI-Ag85C感受态细胞,同源重组敲除inlB1基因;测定... 目的对以绵羊李斯特菌(Listeriaivanovii,LI)为载体的结核疫苗候选株LI-Ag85C进行基因减毒,初步评价其体内外生物学特性。方法构建含有inlB1基因上、下游同源序列的打靶质粒,电转原始菌LI-Ag85C感受态细胞,同源重组敲除inlB1基因;测定减毒株LIΔinlB1-Ag85C和原始株LI-Ag85C的体外生长曲线;测定两株菌对于肝癌细胞系HepG2细胞的黏附、侵袭能力的影响,比较两株菌溶血能力的差异,两株菌对于小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD_(50))差异。结果敲除inlB1基因的重组结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C的基因序列符合预期结果。减毒株与原始株的体外生长情况基本一致;对于HepG2细胞的黏附率分别为6.66%和7.46%,侵袭率分别为0.031%和0.042%,减毒株的黏附、侵袭能力均低于原始株,但差异无统计学意义;减毒株的溶血活性较原始株无明显变化;对小鼠的LD_(50)值分别为3.2×10^(8 )CFU/只和6.7×10^(7 )CFU/只,减毒株LD_(50)相较于原始株明显提高。结论成功构建inlB1基因缺失的新型结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C,其毒力较原始株降低。 展开更多
关键词 绵羊李斯特菌 结核疫苗 inlB1基因敲除 减毒
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