生物催化“一锅法”制备2-氨基丁酸 被引量：6

1

作者 苏金环 郭皓 +1 位作者 曾聪明 文军 《精细化工》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第9期921-924,936,共5页

以克隆表达的苏氨酸脱氨酶(L-TD)和亮氨酸脱氢酶(L-LeuDH)为催化剂,用"一锅法"将天然氨基酸转化为非天然氨基酸,最后结晶回收产物,总收率可达84%左右。所得产物经质谱和核磁共振波谱确证了结构,且HPLC检测其光学纯度>99.9... 以克隆表达的苏氨酸脱氨酶(L-TD)和亮氨酸脱氢酶(L-LeuDH)为催化剂,用"一锅法"将天然氨基酸转化为非天然氨基酸,最后结晶回收产物,总收率可达84%左右。所得产物经质谱和核磁共振波谱确证了结构,且HPLC检测其光学纯度>99.9%。该工艺使用的原料和酶价格低廉,又避免了中间的提取分离过程。 展开更多

关键词 2-氨基丁酸 “一锅法” 苏氨酸 苏氨酸脱氨酶 亮氨酸脱氢酶 精细化工中间体

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包括辅酶原位再生的偶联酶反应联产1，3-二羟基丙酮和2-氨基丁酸 被引量：4

2

作者 苗维娟 王平 张松平 《过程工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第1期102-108,共7页

将甘油脱氢酶(GDH)和亮氨酸脱氢酶(LDH)偶联,以甘油和2-丁酮酸为底物,同时合成1,3-二羟基丙酮(DHA)和2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD+的循环再生.考察了底物和辅酶NAD+浓度对产物产率和辅酶总转换数(TTN)的影响,结果表明,当NAD+初始浓度为0.1... 将甘油脱氢酶(GDH)和亮氨酸脱氢酶(LDH)偶联,以甘油和2-丁酮酸为底物,同时合成1,3-二羟基丙酮(DHA)和2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD+的循环再生.考察了底物和辅酶NAD+浓度对产物产率和辅酶总转换数(TTN)的影响,结果表明,当NAD+初始浓度为0.1μmol/L时,TTN值可达5110;底物甘油和2-丁酮酸的转化率分别为1.4%和2.6%.通过分析各反应底物和产物对GDH和LDH反应初速率的影响,认为产物DHA和2-氨基丁酸对GDH和LDH的强烈抑制效应是造成反应转化率低的主要原因.因此,采取有效的产物去除措施将是提高偶联反应效率的关键. 展开更多

关键词 甘油脱氢酶 亮氨酸脱氢酶 辅酶再生 生物合成

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重组大肠杆菌共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶发酵条件优化 被引量：4

3

作者 刘维明 杨震炯 +4 位作者 罗积杏 壮晓健 沈文和 胡燚 黄和 《生物加工过程》 CAS 2015年第4期23-28,共6页

在摇瓶中对共表达亮氨酸脱氢酶(Leu DH)和甲酸脱氢酶(FDH)的重组大肠杆菌(E.coli)的发酵条件进行优化。首先考察基础培养基中碳、氮源种类和浓度及初始p H等因素对重组大肠杆菌生长和产酶的影响,实验结果表明甘油和酵母膏为最佳碳源和氮... 在摇瓶中对共表达亮氨酸脱氢酶(Leu DH)和甲酸脱氢酶(FDH)的重组大肠杆菌(E.coli)的发酵条件进行优化。首先考察基础培养基中碳、氮源种类和浓度及初始p H等因素对重组大肠杆菌生长和产酶的影响,实验结果表明甘油和酵母膏为最佳碳源和氮源,最适质量浓度均为10 g/L,培养基最适初始p H为8.0。然后对诱导条件进行优化,确定最适的诱导时机为菌体密度(OD600)达到0.6时,最适的诱导温度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间分别为25℃、0.2 mmol/L和20 h。在优化后的培养条件下,菌体密度(OD600)可达8.6,Leu DH和FDH酶比酶活分别达1 543.3和2 572.4 U/L,是优化前的2.0和3.1倍。 展开更多

关键词 重组大肠杆菌 亮氨酸脱氢酶 甲酸脱氢酶 诱导

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亮氨酸脱氢酶研究进展及其工业应用 被引量：4

4

作者 黄春辉 林陈水 《氨基酸和生物资源》 CAS 2012年第2期16-20,共5页

微生物脱氢酶催化羰基不对称还原制备光学纯氨基酸及其衍生物具有非常大的优势。亮氨酸脱氢酶能选择性地催化α-酮酸,氨化还原得到α-氨基酸及其衍生物。本文综述了亮氨酸脱氢酶的来源,理化性质,底物特异性,酶基因工程菌构建等方面的内... 微生物脱氢酶催化羰基不对称还原制备光学纯氨基酸及其衍生物具有非常大的优势。亮氨酸脱氢酶能选择性地催化α-酮酸,氨化还原得到α-氨基酸及其衍生物。本文综述了亮氨酸脱氢酶的来源,理化性质,底物特异性,酶基因工程菌构建等方面的内容及研究进展。从辅酶再生策略,酶膜反应器两方面讨论了其工业化应用,并展望了今后的发展前景。 展开更多

关键词 亮氨酸脱氢酶 辅酶再生 酶膜反应器

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多酶催化拆分DL-正缬氨酸生产L-正缬氨酸 被引量：3

5

作者 戚云龙 杨套伟 +4 位作者 周俊平 郑俊贤 徐美娟 张显 饶志明 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期1015-1021,共7页

L-正缬氨酸是合成抗高血压药物培垛普利的重要中间体,其合成主要通过化学方法,具有产品纯度低、环境污染等缺点.提出一种基于多酶介导拆分DL-正缬氨酸结合不对称还原生产高纯度L-正缬氨酸的方法.首先,将混合型DL-正缬氨酸中的D型经过D-... L-正缬氨酸是合成抗高血压药物培垛普利的重要中间体,其合成主要通过化学方法,具有产品纯度低、环境污染等缺点.提出一种基于多酶介导拆分DL-正缬氨酸结合不对称还原生产高纯度L-正缬氨酸的方法.首先,将混合型DL-正缬氨酸中的D型经过D-氨基酸氧化酶氧化成相应酮酸,然后利用亮氨酸脱氢酶将酮酸不对称还原生成L-正缬氨酸,同时NADH被氧化成NAD^+,最后利用甲酸脱氢酶构建NADH循环再生系统.D-正缬氨酸被氧化过程中会产生副产物过氧化氢(H_2O_2),通过外源添加过氧化氢酶消除该副产物.基于前期最适转化温度、最适转化pH优化基础上,对过氧化氢酶添加量和单次底物添加量进行优化,利用分批补料策略提高L-正缬氨酸产量.结果显示,在最适条件下,L-正缬氨酸产量达到61.09 g/L对映体过量值(e.e.)和转化率分别为99%和96.1%.本研究合成L-正缬氨酸较之化学方法,具有环境污染少、产品纯度高等特点,为制药行业中光学纯L-正缬氨酸的生产提供了一种有效的方法. 展开更多

关键词 酶促拆分 D-氨基酸氧化酶 亮氨酸脱氢酶 NADH循环再生系统 甲酸脱氢酶 L-正缬氨酸

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亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶共表达菌株发酵产酶条件优化及其在L-2-氨基丁酸合成中的应用 被引量：3

6

作者 徐建妙 陈策 +1 位作者 张博 柳志强 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期29-35,共7页

亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸需要辅酶NADH参与,构建 Escherichia coli (LeuDH/FDH),通过共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶实现了辅酶NADH胞内循环再生。通过产酶条件优化,提高该菌株催化制备L-2-氨基丁酸的效率。结果表明,... 亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸需要辅酶NADH参与,构建 Escherichia coli (LeuDH/FDH),通过共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶实现了辅酶NADH胞内循环再生。通过产酶条件优化,提高该菌株催化制备L-2-氨基丁酸的效率。结果表明,在5L发酵罐上,在诱导温度为22 ℃、诱导剂乳糖质量浓度为 8.0 g/L 和诱导时间为17 h的条件下,亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活分别达到79.2 U/g和216.1 U/g,催化效果最佳。利用该菌株全细胞为催化剂,耦合苏氨酸脱氨酶,在1L反应体系中进行了催化反应, L -苏氨酸质量浓度为180 g/L时,无需额外添加辅酶,8 h反应后底物转化率达到99%,L-2-氨基丁酸 e.e.值99.5%以上,时空产率19.3 g/(L·h)。该研究为建立高效、低成本的L-2-氨基丁酸工业化生产方法提供了基础。 展开更多

关键词 L-2-氨基丁酸 亮氨酸脱氢酶 甲酸脱氢酶 共表达 优化

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双启动子促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中表达及发酵研究 被引量：3

7

作者 张玲 王男 +2 位作者 金吕华 林荣 杨海麟 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期21-31,共11页

为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillussubtilis中高效表达,采取在质粒pMA5自带的启动子PHpaII之后分别添加诱导型和组成型启动子,考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子(Pgrac、Pgl-M1)和4种组成型启动子(P43、Plaps、PHpaII、Pam... 为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillussubtilis中高效表达,采取在质粒pMA5自带的启动子PHpaII之后分别添加诱导型和组成型启动子,考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子(Pgrac、Pgl-M1)和4种组成型启动子(P43、Plaps、PHpaII、PamyQ)进行构建表达,其中组成型启动子PamyQ与PHpaII构成的双启动子效果最好,有效地将胞外活性提高到31.24U/ml,是单启动子PHpaII的3.4倍。在以上最优双启动子的基础上分别融合Sec途径和Tat途径的4种信号肽,但信号肽与双启动子共同作用并没有获得更高的酶活性。选用酶活最高的双启动子突变菌株Bacillussubtilis168/pW6(PHpaII-PamyQ)进行7.5L发酵罐补料发酵产酶研究,LeuDH酶活达到217.96U/ml,是摇瓶水平的6.97倍,对工业上产亮氨酸脱氢酶有一定参考价值。 展开更多

关键词 亮氨酸脱氢酶 枯草芽孢杆菌 启动子 信号肽 发酵产酶

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亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶高效共表达制备L-叔亮氨酸 被引量：1

8

作者 杨兴龙 穆晓清 +1 位作者 聂尧 徐岩 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期1709-1718,共10页

【目的】通过不同双基因共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达影响的研究,获得具有高辅酶再生效率的双酶共表达重组生物催化剂,实现L-叔亮氨酸"一锅法"高效不对称合成。【方法】以来自于蜡状芽孢杆菌(... 【目的】通过不同双基因共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达影响的研究,获得具有高辅酶再生效率的双酶共表达重组生物催化剂,实现L-叔亮氨酸"一锅法"高效不对称合成。【方法】以来自于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的亮氨酸脱氢酶(LDH)和来自芽孢菌属(Bacillus sp.)的葡萄糖脱氢酶(GDH)为模板,考察单质粒共表达,双质粒共表达和融合表达等3种共表达策略对重组细胞中亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活的影响,比较不同酶活比例和不同催化剂形式对三甲基丙酮酸不对称还原制备L-叔亮氨酸效率的影响。【结果】研究发现不同共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的影响存在明显差异。亮氨酸脱氢酶在不同策略下均能够正常表达,而葡萄糖脱氢酶在融合表达时没有活力,当C端含有组氨酸标签时,表达蛋白活性低。通过表达优化,获得3株亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶高效表达且具有不同酶活比例的重组菌。比较粗酶液和全细胞形式下的催化效率,发现酶活比例及催化剂形式对不对称还原反应效率具有重要影响。确定单质粒串联表达C端不含His标签重组菌E.coli BL21/p ET28a-L-SD-AS-G为最佳催化剂,以粗酶液进行转化时,完全转化0.5 mol/L底物所需菌体量为15 g/L,辅酶量为0.1 mmol/L。【结论】采用单质粒共表达策略,成功构建出1株具有较高亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活性的重组菌,实现高效催化TMP合成L-Tle。 展开更多

关键词 L-叔亮氨酸 亮氨酸脱氢酶 葡萄糖脱氢酶 共表达策略 C端 His标签

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酶法高效转化苯乙酮酸合成L-苯甘氨酸 被引量：2

9

作者 刘巧利 杨套伟 +3 位作者 周俊平 徐美娟 张显 饶志明 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期451-456,共6页

L-苯甘氨酸是合成多种抗生素和抗癌药物的重要中间体,目前主要通过化学法合成.利用蜡样芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化苯乙酮酸的还原氨基化合成L-苯甘氨酸,并偶联甲酸脱氢酶(FDH)进行辅酶再生,建立了一种新型的苯甘氨酸生物合... L-苯甘氨酸是合成多种抗生素和抗癌药物的重要中间体,目前主要通过化学法合成.利用蜡样芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化苯乙酮酸的还原氨基化合成L-苯甘氨酸,并偶联甲酸脱氢酶(FDH)进行辅酶再生,建立了一种新型的苯甘氨酸生物合成方法.结果表明,该辅酶再生体系可有效地用于L-苯甘氨酸的合成,且没有副产物残留,辅底物甲酸铵还可提供还原氨基化所需NH4+,随后对酶转化条件进行优化,最适转化条件为苯乙酮酸60 g/L,甲酸铵50.4 g/L,LeuDH 4 U/mL,FDH 2 U/mL,NAD+浓度0.14 g/L,p H 8.0以及30℃.在最优条件下,1 L的转化体系中,转化反应5 h,苯乙酮酸转化率达到99%,L-苯甘氨酸产量60.2 g/L,ee值>99%.本研究为L-苯甘氨酸的工业生产提供了一种更加简单、高效、经济的生物合成途径.(图8表4参27) 展开更多

关键词 L-苯甘氨酸 苯乙酮酸 亮氨酸脱氢酶 甲酸脱氢酶 辅酶再生体系

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亮氨酸脱氢酶C端Loop区域的理性设计及多酶级联高效合成L-2-氨基丁酸 被引量：2

10

作者 陈佳杰 徐美娟 +4 位作者 杨套伟 张显 邵明龙 李华钟 饶志明 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期4254-4265,共12页

亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctu... 亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)值,对其波动非常明显的Loop区域合理设计以得到比酶活提高的截短突变体EsLDHD2,其比酶活为野生型的123.2%;此外,由于L-2-氨基丁酸制备过程中苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸制备2-酮丁酸的速率过快导致多酶催化不平衡,因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率,构建多酶级联催化的单细胞E.coliBL21/pACYCDuet-RM,其摩尔转化率相较于E.coliBL21/pACYCDuet-RO提高74.6%;对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM的全细胞转化条件进行优化,其最适pH、温度、底物浓度分别为7.5、35℃和80 g/L,此时摩尔转化率大于99%;在1 L转化体系和最适转化条件下分批加入L-苏氨酸80 g和40 g,L-2-氨基丁酸的产量达97.2g。总之,该策略为L-2-氨基丁酸的制备提供了绿色、高效的合成方法,具有工业化制备药物前体的巨大潜力。 展开更多

关键词 亮氨酸脱氢酶 L-2-氨基丁酸 Loop区域 多酶级联催化 全细胞转化

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用于合成L-2-氨基丁酸基因工程菌的构建 被引量：1

11

作者 郭红颜 梁蕊 +2 位作者 李航 陈代杰 邵雷 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1076-1079,共4页

构建了还原型辅酶Ⅰ(NADH)再生与亮氨酸脱氢酶(LDH)偶联的催化体系,合成甲酸脱氢酶(FDH)基因序列片段,连接入pET28a质粒,构建了pFDH-pET28a,转化入E.coli BL21(DE3)表达。经IPTG诱导后,FDH粗酶液的酶活力约10 u/ml。合成LDH基因序列,连... 构建了还原型辅酶Ⅰ(NADH)再生与亮氨酸脱氢酶(LDH)偶联的催化体系,合成甲酸脱氢酶(FDH)基因序列片段,连接入pET28a质粒,构建了pFDH-pET28a,转化入E.coli BL21(DE3)表达。经IPTG诱导后,FDH粗酶液的酶活力约10 u/ml。合成LDH基因序列,连接入pET21a质粒,构建了pLDH-p ET21a,将该质粒与pFDH-pET28a共转化入E.coli BL21(DE3),共表达FDH与LDH,与苏氨酸脱氨酶(TD)共同催化L-2-氨基丁酸的合成。投料量为7 g/100 ml时,该体系产率可达95%。 展开更多

关键词 还原型辅酶Ⅰ 甲酸脱氢酶 亮氨酸脱氢酶 共表达 L-2-氨基丁酸

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信号肽对亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中分泌表达的影响及酶学性质研究 被引量：1

12

作者 王男 金吕华 +2 位作者 张玲 林荣 杨海麟 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期46-53,共8页

根据信号肽N端电荷数,选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒,首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽Pho D促进蛋白质分泌的效果最好,胞外酶活力达20.25U/ml,为不... 根据信号肽N端电荷数,选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒,首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽Pho D促进蛋白质分泌的效果最好,胞外酶活力达20.25U/ml,为不添加信号肽的2.2倍,信号肽N端较多的电荷数,可能有利于多聚体蛋白的分泌。对表达产物进行纯化和酶学性质测定。结果表明,纯酶比酶活为13U/mg;L-Leucine为底物时酶的Km为6.17mmol/L,Vmax为14.49μmol/（L·min）;底物特异性研究发现,酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好,对一些脂肪族氨基酸也有活性,对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性;酶的最适pH为10.5～12.0,pH稳定范围为5.0～11.0;最适反应温度为55℃;圆二色谱变温扫描酶二级结构变化,α螺旋含量随温度升高逐渐降低;差示扫描微量热技术（DSC）测定酶的解折叠温度（Tm值）为64.13℃,表明该酶具有较好耐热性。 展开更多

关键词 信号肽 亮氨酸脱氢酶 枯草芽孢杆菌 酶学性质

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蜡样芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达及重组酶性质 被引量：1

13

作者 陈宝珍 李红梅 段琳琳 《工业微生物》 CAS CSCD 2015年第4期39-45,共7页

本研究采用PCR技术从蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus基因组DNA中克隆出亮氨酸脱氢酶基因，构建重组表达质粒pET280t（＋）-ldh，实现在大肠杆菌中的高效表达，并分析重组亮氨酸脱氢酶的酶学性质。结果表明，从Bacillus cereus成功克隆的... 本研究采用PCR技术从蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus基因组DNA中克隆出亮氨酸脱氢酶基因，构建重组表达质粒pET280t（＋）-ldh，实现在大肠杆菌中的高效表达，并分析重组亮氨酸脱氢酶的酶学性质。结果表明，从Bacillus cereus成功克隆的亮氨酸脱氢酶编码基因约为1000bp，表达的重组亮氨酸脱氢酶相对分子质量约为40kDa。酶学研究结果表明：该酶的最适反应温度为37℃，其热稳定性好，30℃的半衰期长迭330h；最适反应pH为9．5；在pH7．0-8．0的缓冲液中保存24h后仍保持原有酶活力的80％以上；金属离子Fe2＋对该酶具有明显的促进作用，而EDTA强融抑制亮氨酸脱氢酶的活性。动力学分析结果表明该酶对底物NADH催化的km和Vmax。分别为0．635mmol／L和1．54μmol／（L·min）。亮氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的成功表达为手性氨基酸的生物合成提供了可能。 展开更多

关键词 蜡样芽孢杆菌 克隆表达 亮氨酸脱氢酶 酶学性质

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亮氨酸脱氢酶催化底物偶联法合成α-酮异己酸

14

作者 丰险 穆晓清 +1 位作者 聂尧 徐岩 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2019年第4期698-704,共7页

构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系,打破氧化脱氨反应平衡,同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD^+的高效循环再生.基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数,考察了不同酮酸底物对于底物... 构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系,打破氧化脱氨反应平衡,同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD^+的高效循环再生.基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数,考察了不同酮酸底物对于底物偶联反应效率的影响,选择转化率最高的2-丁酮酸作为偶联底物,使α-KIC产率由单步氧化反应的2. 75%提高至66. 82%.通过考察底物浓度、pH值、NH_4^+浓度和辅酶NAD^+浓度等反应条件对偶联反应效率的影响,使α-KIC产率进一步提高至83. 25%,同时辅酶NAD^+的总转化数(TTN)达到5. 88×105.通过改变底物L-亮氨酸和2-丁酮酸的摩尔比,能够将α-KIC的产率进一步提高至92. 74%. 展开更多

关键词 亮氨酸脱氢酶 底物偶联 辅酶再生 α-酮异己酸 L-2-氨基丁酸

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生物转化产d-伪麻黄碱菌株的筛选及其关键酶基因的验证

15

作者 柴满坤 张梁 +2 位作者 顾正华 丁重阳 石贵阳 《生物加工过程》 CAS CSCD 2013年第3期34-39,共6页

利用GenBank和UniProt数据库比对Morganella morganii J-8羰基还原酶基因和氨基酸序列,以同源性为依据,结合高效液相色谱(HPLC)检测验证,筛选出5株同样具有转化1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)产d-伪麻黄碱功能的菌株。选取其中1株Bacillus cl... 利用GenBank和UniProt数据库比对Morganella morganii J-8羰基还原酶基因和氨基酸序列,以同源性为依据,结合高效液相色谱(HPLC)检测验证,筛选出5株同样具有转化1-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK)产d-伪麻黄碱功能的菌株。选取其中1株Bacillus clausii B0658,对其d-伪麻黄碱的生物转化过程进行考察,发现在最优条件下d-伪麻黄碱产量达到128.3 mg/L。进一步对B.clausii B0658的亮氨酸脱氢酶基因bcdh进行扩增,以pET28a(+)为载体构建重组质粒并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现表达,通过重组菌的生物转化实验验证该酶的催化功能。 展开更多

关键词 d-伪麻黄碱 羰基还原酶 亮氨酸脱氢酶

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D-扁桃酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶级联催化的L-苯甘氨酸对映选择性生物合成 被引量：2

16

作者 史红玲 王文杰 +5 位作者 李祥 焦铸锦 刘钺 唐存多 阚云超 姚伦广 《应用化学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期168-174,共7页

L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓... L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓度的辅酶即可实现生物催化D-扁桃酸合成L-苯甘氨酸。通过对加酶量、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^+)浓度、NH+4浓度和底物浓度等因素进行优化,获得了一个最经济的反应条件:200 mmol/L的D-扁桃酸、6.5 kU/L的加酶量、0.1 mmol/L NAD^+、0.5 mol/L NH4^+的条件下、30℃,反应12h,在此条件下,产物的得率和对映体过量(e.e.)值分别可达98%和99%以上,具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。 展开更多

关键词 L-苯甘氨酸 D-扁桃酸脱氢酶 L-亮氨酸脱氢酶 生物催化 级联反应

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