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致病性钩端螺旋体脉冲场凝胶电泳图谱分型研究 被引量：13
1
作者 蒋秀高 肖玉春 +2 位作者 聂一新 秦进才 时曼华 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期378-381,共4页
目的　建立我国 15群 15型钩端螺旋体标准菌株染色体DNA脉冲场凝胶电泳图谱 ,进行致病性钩体的分子遗传学分类鉴定。方法　采用低熔点琼脂糖凝胶块直接纯化钩体菌完整的染色体DNA ,用限制性内切酶NotⅠ消化后 ,进行脉冲场凝胶电泳分离... 目的　建立我国 15群 15型钩端螺旋体标准菌株染色体DNA脉冲场凝胶电泳图谱 ,进行致病性钩体的分子遗传学分类鉴定。方法　采用低熔点琼脂糖凝胶块直接纯化钩体菌完整的染色体DNA ,用限制性内切酶NotⅠ消化后 ,进行脉冲场凝胶电泳分离。结果　从 5 0～ 10 0 0kb范围的DNA片段得到很好的分离效果 ,我国常见 15群 15型国内标准菌株各具特异性脉冲场凝胶电泳图谱。结论　脉冲场凝胶电泳图谱可对钩体菌进行遗传学分类鉴定 。 展开更多
关键词 致病性钩端螺旋体 脉冲场凝胶电泳 分子流行病学
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问号钩端螺旋体血清群LipL41基因型分析及其表达产物的免疫学鉴定 被引量：10
2
作者 丁威 严杰 毛亚飞 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第11期859-865,共7页
目的　确定我国 15群 15株问号钩端螺旋体 (简称钩体 )参考标准株和 2群 2株双曲钩体国际标准株携带LipL4 1基因情况 ,构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫原性。方法常规酚 氯仿法提取上述 17株钩体基因组DNA ,高保真PCR扩... 目的　确定我国 15群 15株问号钩端螺旋体 (简称钩体 )参考标准株和 2群 2株双曲钩体国际标准株携带LipL4 1基因情况 ,构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫原性。方法常规酚 氯仿法提取上述 17株钩体基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL4 1基因片段 ,T A克隆后测序分型。构建LipL4 1基因原核表达系统 ,SDS PAGE检测重组目的蛋白 (rLipL4 1)表达情况。分别用钩体属特异性TR patocⅠ抗原、rLipL4 1兔抗血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和抗原性。分别用显微镜凝集试验 (MAT)、钩体黏附J774A .1细胞模型检测兔抗rLipL4 1血清的交叉凝集效价和黏附阻断作用。结果　 15株问号钩体均有LipL4 1基因 ,并可分为LipL4 1 1和LipL4 1 2两种基因型 ,2株双曲钩体则否。 11个LipL4 1 1基因和 4个LipL4 1 2基因克隆之间的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88.6 1%～ 88.6 7%和 93.2 4 %～ 97.18%。所构建的原核表达系统rLipL4 1 1和rLipL4 1 2的表达量分别占钩体总蛋白的 30 %和 4 0 %。rLipL4 1 1和rLipL4 1 2均能与TR patocⅠ抗血清发生结合反应 ,免疫家兔能产生抗体。rLipL4 1 1和rLipL4 1 2兔抗血清对上述 15株问号钩体MAT效价为 1∶8～ 1∶12 8、1∶16～1∶2 5 6稀释时均能有效地阻断钩体对细胞的黏附。结? 展开更多
关键词 钩体 问号钩端螺旋体 基因 原核表达系统 免疫学鉴定 免疫反应性 血清群 兔抗血清 高效表达 表达产物
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钩端螺旋体脉冲场凝胶电泳标准化技术的建立及谱型特征初步分析 被引量：12
3
作者 张艳 郭宗琪 +3 位作者 李秀文 崔志刚 聂一新 蒋秀高 《中华流行病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期772-775,共4页
目的建立中国钩端螺旋体(钩体)脉冲场凝胶电泳(PFGE)的标准化操作程序及中国15群15型代表菌株的图谱数据库。方法参照目前美国疾病控制中心及亚太地区PulseNet提供的其他病原体PFGE标准化操作程序,结合钩体菌株的特性,对菌体基因组染色... 目的建立中国钩端螺旋体(钩体)脉冲场凝胶电泳(PFGE)的标准化操作程序及中国15群15型代表菌株的图谱数据库。方法参照目前美国疾病控制中心及亚太地区PulseNet提供的其他病原体PFGE标准化操作程序,结合钩体菌株的特性,对菌体基因组染色体DNA纯化技术、限制性内切酶消解方案及脉冲场电泳参数进行优化。结果利用标准化PFGE操作程序,建立了中国15群15型钩体代表菌株基因组DNA的NotⅠ酶切图谱,并对历年从四川、安徽省钩体病监测工作现场分离的部分黄疸出血群菌株进行PFGE分析,结果发现中国15群15型钩体代表菌株各自具有独特的谱型特征,24株黄疸出血群分离株存在3种谱型特征,91.67%(22/24)的分离株与黄疸出血群赖型(56601)的谱型匹配。结论建立的PFGE标准化操作程序制作钩体菌株的酶切图谱,具有图像清晰、分辨率高、各种大小的片段分布均匀等特点,能较好地反映出中国钩体菌株的分子遗传学特征,与传统的血清学分类存在较好的相关性。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 脉冲场凝胶电泳 分子遗传学分型
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问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL41/1融合基因原核表达系统的构建及其应用 被引量：9
4
作者 罗冬娇 严杰 +3 位作者 毛亚飞 李淑萍 罗依惠 李立伟 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2005年第1期27-32,共6页
目的 :构建问号钩端螺旋体 (简称钩体 ) lip L 32 / 1- lip L 4 1/ 1融合基因及其原核表达系统 ,了解钩体野生株 lip L32和 lip L4 1基因携带和表达情况及钩体患者的血清抗体水平。方法 :采用连接引物 PCR构建 lip L32 / 1- li-p L4 1/ ... 目的 :构建问号钩端螺旋体 (简称钩体 ) lip L 32 / 1- lip L 4 1/ 1融合基因及其原核表达系统 ,了解钩体野生株 lip L32和 lip L4 1基因携带和表达情况及钩体患者的血清抗体水平。方法 :采用连接引物 PCR构建 lip L32 / 1- li-p L4 1/ 1融合基因 ,常规方法构建其原核表达系统。采用 SDS- PAGE检测目的重组蛋白 r L ip L32 / 1- r L ip L4 1/ 1表达情况。采用 Western blot鉴定 r Lip L32 / 1- r Lip L4 1/ 1的免疫原性。采用 PCR和 MAT分别检测 97株问号钩体野生株 lip L32和 lip L4 1基因及其表达情况。采用 EL ISA检测 2 2 8例钩体患者血清 lip L32和 lip L4 1基因产物的抗体。结果 :与报道的相关序列比较 ,lip L 32 / 1- lip L 4 1/ 1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为 99.9%和99.8%。目的重组蛋白 r Lip L32 / 1- r Lip L4 1/ 1表达产量约为细菌总蛋白的 10 % ,主要以包涵体形式存在。r L ip L32 /1和 r Lip L4 1/ 1兔抗血清均能与 r L ip L32 / 1- r L ip L4 1/ 1结合。 97.9%和 87.6 %问号钩体野生株分别有 lip L32和 li-p L4 1基因。95 .9%和 84 .5 %问号钩体野生株分别与 r Lip L32 s和 r Lip L4 1s兔抗血清出现效价 ,为 1∶ 4～ 1∶ 12 8的MAT阳性结果。分别有 94 .7%～ 97.4 %和 78. 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号 lipL32基因 lipL41基因 序列同源性 核酸 序列同源性 氨基酸 基因表达 克隆 分子 lipL32/1-lipL41/1融合基因/免疫学
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中越河口-老街边境地区鼠传疾病病原的调查研究 被引量：9
5
作者 孙肖红 张乐 +6 位作者 张建春 魏莲 张晓龙 高旭 周麟 张勋 王静 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2010年第2期73-76,共4页
〔目的〕掌握中越河口—老街边境地区鼠携带汉坦病毒、钩端螺旋体和鼠疫杆菌的情况。〔方法〕2008年11月和2009年4月在云南省河口县和越南老街市的居民区用鼠笼捕鼠,取鼠肺、肝和肾脏组织。从鼠肺中提取RNA,用RT-PCR方法扩增汉坦病毒核... 〔目的〕掌握中越河口—老街边境地区鼠携带汉坦病毒、钩端螺旋体和鼠疫杆菌的情况。〔方法〕2008年11月和2009年4月在云南省河口县和越南老街市的居民区用鼠笼捕鼠,取鼠肺、肝和肾脏组织。从鼠肺中提取RNA,用RT-PCR方法扩增汉坦病毒核酸;从鼠肝和肾脏中提取DNA,用PCR方法分别扩增鼠疫杆菌和钩端螺旋体核酸。〔结果〕在河口—老街边境地区捕获黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠、小家鼠、臭鼳鼱和斯氏家鼠共198只,黄胸鼠数量最多,占总数的79.8%;从老街黄胸鼠鼠肺中检测到3份汉坦病毒核酸,阳性率为4.41%;从河口黄胸鼠、褐家鼠和大足鼠鼠肾中共检测到7份钩端螺旋体核酸,河口黄胸鼠钩端螺旋体核酸阳性率为11.36%;未检测到鼠疫杆菌核酸。〔结论〕中越河口—老街边境地区鼠传疾病病原有汉坦病毒和钩端螺旋体,应加强当地鼠传疾病的监测。 展开更多
关键词 汉坦病毒 钩端螺旋体 鼠疫杆菌 病原 边境
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钩端螺旋体毒力相关基因的分布特点分析 被引量：6
6
作者 赵莉 蒋秀高 +2 位作者 聂一新 肖玉春 徐建国 《中华流行病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第12期1122-1125,共4页
目的　探讨钩端螺旋体 (钩体 )毒力相关基因的分布特点。方法　根据钩体赖型赖株全基因组序列的生物信息学分析资料 ,选择了 12个可能与钩体毒力相关的基因 ,采用聚合酶链反应(PCR)方法 ,对中国问号钩体 38株参考菌株和 81株分离的野生... 目的　探讨钩端螺旋体 (钩体 )毒力相关基因的分布特点。方法　根据钩体赖型赖株全基因组序列的生物信息学分析资料 ,选择了 12个可能与钩体毒力相关的基因 ,采用聚合酶链反应(PCR)方法 ,对中国问号钩体 38株参考菌株和 81株分离的野生菌株 ,以及 12株非致病性的双曲钩体共 131株菌株进行了检测。结果　问号钩体中各毒力相关基因分布广泛 ,双曲钩体中仅检测到个别毒力相关基因。lipL32基因存在于所有检测的问号钩体 ,lipL36基因在问号钩体不同菌株中的变异较大 ,阳性检测率为 0 %～ 90 .91% ;la16 0 8基因在问号钩体黄疸出血群菌株中阳性检测率为87.5 0 % ,而在其他血清群菌株间阳性检测率为 0 %～ 2 5 .0 0 % ,sphA基因仅在问号钩体少数菌株中能检测到 ,阳性检测率为 17.6 5 % ,且在中国赛罗群哈焦型参考菌株中未检测到。结论　这些基因可能是问号钩体重要的毒力相关基因。其中lipL32可能是问号钩体各血清群菌株共同抗原的编码基因 ;lipL36基因可能和问号钩体血清群特异性和多样性有关 ;la16 0 8基因可能是黄疸出血群菌株特有的基因 ;哈焦型菌株与问号钩体菌株在基因结构具有较大的差异。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 毒力相关基因 分布特点 聚合酶链反应
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黄疸出血群钩端螺旋体MLVA分型研究 被引量：8
7
作者 张翠彩 聂一新 +6 位作者 李秀文 崔志刚 郭宗琪 顾黎莉 徐建民 吴子贵 蒋秀高 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1144-1147,共4页
目的初步探讨MLVA（multiple—locus variable—number tandem-repeat analysis）技术在黄疸出血群钩端螺旋体基因分型中的应用。方法选取7个VNTR位点，对我国致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取基因组DNA，采用PCR扩增和琼脂糖凝胶电... 目的初步探讨MLVA（multiple—locus variable—number tandem-repeat analysis）技术在黄疸出血群钩端螺旋体基因分型中的应用。方法选取7个VNTR位点，对我国致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取基因组DNA，采用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术检测，应用BioNumerics（Vetsion4．0）软件进行聚类分析。结果共对117株钩端螺旋体的7个VNTR位点进行了检测，聚类分析分为3个群（A群、B群、C群）28种基因型，其中A群占11．97％（14／117）、B群占0．85％（1／117）、C群占87．18％（102／117）；多态性指数介于0．0831与0．8005之间；MLVA基因型存在明显的地域性。结论MLVA分型技术可初步对钩端螺旋体进行遗传学分类鉴定，应用该技术，将在钩体病分子流行病学研究中发挥重要的作用。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 黄疸出血群 基因分型 MLVA
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不同毒力的问号钩端螺旋体对Vero及J774A.1细胞的黏附和内化 被引量：6
8
作者 李立伟 严杰 +1 位作者 毛亚飞 李淑萍 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期98-102,共5页
目的　探讨问号钩端螺旋体对传代细胞黏附和内化的能力及其差异。方法　实验中采用非洲绿猴肾成纤维细胞 (Vero)和小鼠单核巨噬样细胞 (J774A .1)细胞株。采用透射电镜、扫描电镜和Fontana镀银染色法 ,观察问号钩端螺旋体强毒株黄疸出... 目的　探讨问号钩端螺旋体对传代细胞黏附和内化的能力及其差异。方法　实验中采用非洲绿猴肾成纤维细胞 (Vero)和小鼠单核巨噬样细胞 (J774A .1)细胞株。采用透射电镜、扫描电镜和Fontana镀银染色法 ,观察问号钩端螺旋体强毒株黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1、弱毒株波摩那群波摩那型 5 6 6 0 8黏附细胞及内化能力及其差异 ,采用腐生性的双曲钩端螺旋体三宝垄群patoc型PatocⅠ株作为对照。结果　问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株和波摩那群波摩那型 5 6 6 0 8株均能以一端或两端黏附于Vero及J774A .1细胞。钩体 5 6 6 0 1株和 5 6 6 0 8株对J774A .1的黏附率分别为 4 9%和4 6 .9% ,对Vero细胞黏附率分别为 2 4 .2 %和 2 2 .9%。钩体 5 6 6 0 1株和 5 6 6 0 8株可侵入上述 2株细胞 ,在胞质内形成典型的吞噬泡。钩体 5 6 6 0 1株还可侵入宿主细胞核内 ,5 6 6 0 8株则否。双曲钩端螺旋体三宝垄群patoc型PatocⅠ株不能黏附和侵入细胞。结论　两株受试的不同毒力问号钩体株均能黏附细胞 ,并以内化方式侵入细胞。细胞株的差异可明显影响钩体黏附和内化能力。问号钩体毒力的强弱可能与黏附能力无关 ,而与其侵入胞核的能力密切相关。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 单核巨噬样细胞 成纤维细胞 细胞黏附 细胞内化
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问号钩端螺旋体检测基因芯片的研制 被引量：7
9
作者 唐雨德 陶开华 +3 位作者 李越希 金慧英 张锦海 郭恒彬 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第4期311-314,共4页
目的　制备一种用于快速检测、鉴定问号钩端螺旋体的DNA微阵列芯片。方法　从Genbank中选取钩体 2 3SrDNA序列 ,设计一对种特异性引物和DNA探针 ,通过Blast的基因同源性比较 ,验证引物和探针的通用性与特异性。将合成的探针点样到玻片... 目的　制备一种用于快速检测、鉴定问号钩端螺旋体的DNA微阵列芯片。方法　从Genbank中选取钩体 2 3SrDNA序列 ,设计一对种特异性引物和DNA探针 ,通过Blast的基因同源性比较 ,验证引物和探针的通用性与特异性。将合成的探针点样到玻片上制备成基因芯片。用Cy3标记引物 ,通过不对称PCR反应获取荧光素标记的靶序列 ,然后与制备的芯片杂交。结果　设计的引物与探针仅同时与问号钩体 2 3srDNA完全同源。该引物可扩增我国 18个血清群的 2 5株钩体 ,均出现单一 4 82bp的扩增产物 ,而双曲钩体及其他螺旋体、病原、空白对照均无任何DNA扩增条带。芯片杂交结果与常规PCR方法结果一致 ,敏感性高于PCR。结论　基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测问号钩端螺旋体。 展开更多
关键词 检测 基因芯片 研制 问号钩端螺旋体
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问号钩端螺旋体感染对内皮细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响 被引量：7
10
作者 陈旭 刘英 +2 位作者 王铭 严杰 李世军 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期248-253,共6页
目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体）感染对内皮细胞表面细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）表达的影响及差异。方法采用问号钩体赖株体外感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后运用real-time RT-PCR技术检测细胞ICA... 目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体）感染对内皮细胞表面细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）表达的影响及差异。方法采用问号钩体赖株体外感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后运用real-time RT-PCR技术检测细胞ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达水平。采用组织镀银染色法检测问号钩体感染C3H/HeJ小鼠后肺、肝、肾组织内钩体侵袭情况。采用免疫组化法检测小鼠肺、肝、肾组织中ICAM-1和VCAM-1表达的差异。结果问号钩体感染HUVEC后细胞ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达水平与感染前相比均显著升高（P〈0.05），且VCAM-1 mRNA表达水平显著高于ICAM-1（P〈0.05）。组织镀银染色结果显示在感染C3H/HeJ小鼠肺、肝、肾组织内均出现入侵钩体。免疫组化结果显示，问号钩体感染小鼠后，肺、肝、肾组织内均出现ICAM-1和VCAM-1表达升高，但VCAM-1的表达量显著高于ICAM-1（P〈0.05）。结论问号钩体感染可激活内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达，且VCAM-1的表达量显著高于ICAM-1，从而介导特异性炎症细胞浸润至感染部位。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 黏附分子 细胞间黏附分子-1 血管细胞黏附分子-1
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多位点序列分型应用于致病性黄疸出血群钩端螺旋体分析 被引量：6
11
作者 张翠彩 徐建民 +2 位作者 李秀文 曹志强 蒋秀高 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期395-398,共4页
目的初步探讨MLST(multilocus sequence typing)分型技术在致病性钩端螺旋体中的应用。方法对我国3个省份的39株致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取DNA,采用7个位点进行PCR扩增、序列测定,应用eBURST和BioNumerics(Version5.10)软件进... 目的初步探讨MLST(multilocus sequence typing)分型技术在致病性钩端螺旋体中的应用。方法对我国3个省份的39株致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取DNA,采用7个位点进行PCR扩增、序列测定,应用eBURST和BioNumerics(Version5.10)软件进行分析。结果 39株菌株呈现5个ST型别,ST1为中国三省份中主要的基因型,占53.85%(21/39)。eBURST分析显示:39株菌株分为2个Clonal complexes和1个singleton,其中Group1占66.67%(26/39),Group2占20.51%(8/39),一个singleton占12.82%(5/39);BioNumerics软件聚类分析显示:39株菌株分为3个Group,与eBURST分析中的分群结构一致。MLST基因型别具有明显的地域性特征。结论 MLST方法可初步应用于致病性钩端螺旋体分子流行病学、种群结构、亲缘进化关系等研究。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 黄疸出血群 基因分型 MLST
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山西省长治市宠物犬人兽共患病病原菌及巴贝虫感染状况调查
12
作者 崔永洁 刘益萍 +3 位作者 崔佳 饶华祥 栗冬梅 于娟 《中国媒介生物学及控制杂志》 CAS 2024年第2期232-236,共5页
目的了解山西省长治市巴尔通体、伯氏疏螺旋体、嗜吞噬细胞无形体、致病性钩端螺旋体(钩体)及巴贝虫等5类人兽共患病病原菌在宠物犬中的感染状况。方法收集宠物犬抗凝血,采用实时荧光定量PCR(qPCR)法进行巴尔通体、伯氏疏螺旋体、嗜吞... 目的了解山西省长治市巴尔通体、伯氏疏螺旋体、嗜吞噬细胞无形体、致病性钩端螺旋体(钩体)及巴贝虫等5类人兽共患病病原菌在宠物犬中的感染状况。方法收集宠物犬抗凝血,采用实时荧光定量PCR(qPCR)法进行巴尔通体、伯氏疏螺旋体、嗜吞噬细胞无形体、钩体等细菌性病原体的检测,采用普通PCR法进行巴贝虫的检测,并对阳性PCR产物进行序列测定和分析。组间感染率的差异比较采用Fisher确切概率法。结果共收集98份宠物犬血液标本,结果显示巴尔通体阳性率为4.08%(4/98),伯氏疏螺旋体阳性率为3.06%(3/98),嗜吞噬细胞无形体阳性率为7.14%(7/98),巴贝虫阳性率为3.06%(3/98),钩体未检出。不同性别、犬龄以及是否接种疫苗的犬只中,各病原体检出率差异均无统计学意义(Fisher确切概率法,P>0.05)。有2只宠物犬存在共感染现象,具体为巴尔通体和嗜吞噬细胞无形体共感染1只,伯氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞无形体共感染1只。2份巴贝虫阳性标本测序成功,遗传进化分析显示均为吉氏巴贝虫。结论山西省长治市宠物犬感染多种人兽共患病病原体,具有感染人和其他动物的潜在风险,须做好宠物犬只的管理和疫病防控。 展开更多
关键词 宠物犬 巴尔通体 伯氏疏螺旋体 嗜吞噬细胞无形体 致病性钩端螺旋体 巴贝虫
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钩端螺旋体磷酸二酯酶基因LARS06960的鉴定及其相关生物学功能初探
13
作者 姚文武 杨章女 +2 位作者 王凌波 吴卓颖 胡玮琳 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期672-679,共8页
目的确定钩端螺旋体LARS06960基因产物蛋白具有磷酸二酯酶(PDE)活性,确定该酶降解的底物细菌二核苷酸可激活巨噬细胞固有免疫因子。方法PCR扩增钩端螺旋体56601株LARS06960基因并构建原核表达系统。通过Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的... 目的确定钩端螺旋体LARS06960基因产物蛋白具有磷酸二酯酶(PDE)活性,确定该酶降解的底物细菌二核苷酸可激活巨噬细胞固有免疫因子。方法PCR扩增钩端螺旋体56601株LARS06960基因并构建原核表达系统。通过Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白rPDE。高效液相色谱法(HPLC)检测rPDE降解细菌二核苷酸c-di-AMP或5′-pApA底物为AMP的活性。荧光定量RT-PCR法检测钩端螺旋体感染巨噬细胞过程中钩体LARS06960基因和细胞固有免疫相关因子基因mRNA水平变化。采用荧光定量RT-PCR法和ELISA法检测细菌二核苷酸影响细胞固有免疫相关因子表达及分泌水平变化。结果成功构建钩端螺旋体LARS06960基因原核表达系统,纯化的rPDE具有体外降解5′-pApA和c-di-AMP为AMP的功能。钩端螺旋体感染巨噬细胞过程中,钩体LARS06960基因表达水平显著下降,巨噬细胞IFN-β、TNF-α、IL-6以及IL-1β编码基因表达水平均显著升高。LARS06960编码的PDE酶降解底物细菌二核苷酸可诱导IFN-β和IL-6基因mRNA表达水平或蛋白分泌水平的升高。结论LARS06960基因产物PDE具有PDE活性,其水解底物细菌二核苷酸激活巨噬细胞固有免疫应答。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 磷酸二酯酶 固有免疫
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江西省钩端螺旋体分离株脉冲场凝胶电泳分型和分析 被引量：6
14
作者 徐建民 蒋秀高 +3 位作者 李秀文 张艳 王健 熊长辉 《中华流行病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期434-437,共4页
目的采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术，对江西省钩端螺旋体（钩体）患者及动物宿主中分离的钩体菌株型别进行分子流行病学调查。方法利用核酸内切酶NotI对提取的钩体菌株染色体DNA进行酶切，通过PFGE将DNA片段分离。获得的PFGE图像采用... 目的采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术，对江西省钩端螺旋体（钩体）患者及动物宿主中分离的钩体菌株型别进行分子流行病学调查。方法利用核酸内切酶NotI对提取的钩体菌株染色体DNA进行酶切，通过PFGE将DNA片段分离。获得的PFGE图像采用分析软件BioNumerics4．0进行处理并建立数字化数据库，以相似度〉75％为标准，将获各钩体PFGE图谱与中国15群15型钩体参考标准株进行比较并进行聚类分析。结果江西省不同地区的139株钩体可分为46个PFGE型，优势型为LepNotI．0071、LepNotI．0072和LepNotI．0043型，分别占所有钩体菌株的28．06％、15．11％和7．19％。139株钩体分离株中，84．89％（118／139）菌株的PFGE图谱与6群6型中国钩体参考标准株基本相符，其中32．37％（45／139）钩体菌株属于黄疸出血群赖型，15．83％（22／139）和15．11％（21／139）钩体菌株分别属于澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型。结论PFGE是一种快速、准确、高效的钩体分型方法。黄疸出血群赖型是江西省人群及动物中优势血清型，澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型位于其次。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 脉冲场凝胶电泳 分型 分子流行病学
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重庆市2021-2022年鼠传病原体监测结果分析 被引量：2
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作者 肖汉森 何亚明 +3 位作者 涂涛田 张应 王政 季恒青 《中国媒介生物学及控制杂志》 CAS 北大核心 2023年第5期628-632,共5页
目的监测重庆市重点地区小型兽类携带5种常见鼠媒病原体的流行情况,为指导当地鼠源疾病的防控提供科学依据。方法2021-2022年,在重庆市中心城区、万州区、涪陵区3个监测点使用笼夜法捕捉小型兽类,提取其肝、脾、肺、肾组织的核酸样本,... 目的监测重庆市重点地区小型兽类携带5种常见鼠媒病原体的流行情况,为指导当地鼠源疾病的防控提供科学依据。方法2021-2022年,在重庆市中心城区、万州区、涪陵区3个监测点使用笼夜法捕捉小型兽类,提取其肝、脾、肺、肾组织的核酸样本,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测问号钩端螺旋体(钩体)、莫氏立克次体、巴尔通体,反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测汉坦病毒及大别班达病毒。运用Excel 2010软件进行数据汇总和整理,SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析,种群构成比、病原体携带率的比较采用χ^(2)检验进行统计分析。结果共捕获小型兽类9种1188只,其中褐家鼠最多,占比为33.50%,黄胸鼠占比为26.77%,四川短尾鼩占比26.01%,小家鼠占比为9.85%,其余还捕获小泡巨鼠、大足鼠、北社鼠、黑线姬鼠、灰麝鼩,不同监测点的小型兽类种类构成差异有统计学意义(χ^(2)=714.786,P<0.001)。所有检测样本中,发现汉城型汉坦病毒阳性4份(只),问号钩体阳性24份(只),巴尔通体阳性8份(只),其余均为阴性。共发现33只小型兽类呈阳性,其中2只黄胸鼠、1只褐家鼠同时携带问号钩体和汉城型汉坦病毒,病原体总体携带率为2.78%,其中汉坦病毒总携带率为0.34%,问号钩体总携带率为2.02%,巴尔通体总携带率为0.67%,3种病原体的携带率差异有统计学意义(χ^(2)=18.857,P<0.001)。结论重庆地区小型兽类中监测到问号钩体、巴尔通体和汉坦病毒,检出阳性较多的小型兽类为褐家鼠、黄胸鼠和四川短尾鼩,主要分布于重庆城区的重点行业和万州区的农村居民区,当地应对鼠源疾病流行及防控予以重点关注。 展开更多
关键词 小型兽类 鼠传病原体 汉坦病毒 问号钩端螺旋体 巴尔通体
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钩端螺旋体脂多糖诱生炎性细胞因子及小鼠感染组织中单核-巨噬细胞浸润 被引量：5
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作者 胡小伟 陈旭 +3 位作者 方佳琪 李凯旋 赵金方 严杰 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期817-823,共7页
目的：了解问号钩端螺旋体脂多糖（ L-LPS）诱导人单核细胞或小鼠单核-巨噬细胞产生炎性细胞因子的作用以及问号钩端螺旋体感染后小鼠内脏组织中外周血单核-巨噬细胞浸润情况。方法采用酚水法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株L-LP... 目的：了解问号钩端螺旋体脂多糖（ L-LPS）诱导人单核细胞或小鼠单核-巨噬细胞产生炎性细胞因子的作用以及问号钩端螺旋体感染后小鼠内脏组织中外周血单核-巨噬细胞浸润情况。方法采用酚水法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株L-LPS并用鲎试验测定其内毒素活性。采用细胞因子抗体芯片，检测L-LPS作用或问号钩端螺旋体赖株感染后人THP-1单核细胞株或小鼠J774A.1单核-巨噬细胞产生细胞因子情况。分别采用HRP标记外周血单核-巨噬细胞特异性CD68抗体免疫组化法和细胞因子抗体芯片，分别检测问号钩端螺旋体赖株感染C3H/HeJ小鼠肺、肝、肾组织中单核-巨噬细胞浸润情况以及血清细胞因子水平。结果 L-LPS凝固鲎试剂活性约为大肠埃希菌脂多糖（E-LPS）的1/5。 L-LPS作用后THP-1或J774A.1细胞分别有29和9种细胞因子水平明显升高（P〈0.05或P〈0.01），其中主要促炎细胞因子为IL-6和TNF-α，同时包含多种单核-巨噬细胞趋化因子表达增强。问号钩端螺旋体感染细胞上清或感染小鼠血清中细胞因子检测结果与L-LPS作用细胞相似。问号钩端螺旋体赖株感染小鼠后，肺、肝、肾组织中出现大量外周血单核-巨噬细胞浸润。结论 L-LPS具有很强的诱导单核-巨噬细胞上调多种促炎细胞因子和单核-巨噬细胞趋化因子表达的作用，单核-巨噬细胞是问号钩端螺旋体感染小鼠内脏组织中浸润的主要炎症细胞。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 脂多糖 炎性细胞因子 单核-巨噬细胞 浸润
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感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体外膜蛋白抗原表达差异性 被引量：5
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作者 孙萍萍 林旭瑷 +1 位作者 李立伟 严杰 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期224-231,共8页
目的了解感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体（简称钩体）外膜蛋白表达变化，为选择钩体基因工程疫苗候选抗原提供依据。方法采用TritonX-114法提取感染THP-1细胞前后问号钩体黄疸出血群赖型赖株外膜蛋白。采用双向电泳技术分离钩体外... 目的了解感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体（简称钩体）外膜蛋白表达变化，为选择钩体基因工程疫苗候选抗原提供依据。方法采用TritonX-114法提取感染THP-1细胞前后问号钩体黄疸出血群赖型赖株外膜蛋白。采用双向电泳技术分离钩体外膜蛋白，银染色法检测感染前后钩体外膜蛋白表达量及其差异。感染细胞后4个表达显著上调和4个表达显著下调的钩休蛋白点胰酶水解后，采用LC—MS／MS方法进行鉴定。应用生物信息学软件分析靶蛋白跨膜区和信号肽，采用实时荧光定量RT—PCR检测感染细胞前后靶基因mRNA水平变化。构建靶基因原核表达系统，采用钩体感染豚鼠模型了解重组靶蛋白的免疫保护作用。结果感染THP-1细胞60rain后，问哆钩体赖株外膜蛋白中Loa22、GroEL、FOF1ATP合成酶饯和B亚单位表达水平均显著升高（P〈0．05），FlaB2、LigB、OmpA和OmpA家族蛋白表达显著下降（P〈0．05），实时荧光定昂RT—PCR检测结果与之基本一致。生物信息学分析结果显示，上述8个外膜蛋白中，OmpA和OmpA家族蛋白为跨膜蛋白，其余均无跨膜结构，Loa22、LigB和OmpA家族蛋白含有信号肽。200斗g重组表达的靶蛋白rLoa22或rGroEL对豚鼠的免疫保护率均为75．0％。结论问号钩体赖株感染细胞时外膜蛋白表达谱可发生明显变化。感染后高表达的钩体外膜蛋白尤其是GroEL和Loa22，可作为钩体基因工程疫苗侯选抗原。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 外膜蛋白 双向电泳
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问号钩端螺旋体属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答 被引量：5
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作者 孙百莉 郭宗琪 +2 位作者 罗冬娇 孙军德 严杰 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期329-334,共6页
为了确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型,为OmpL1s用于研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒抗原提供依据。采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区156份钩体病人血清标本。用PCR和... 为了确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型,为OmpL1s用于研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒抗原提供依据。采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区156份钩体病人血清标本。用PCR和核苷酸序列分析,了解中国流行的钩体主要血清群ompL1基因型。采用常规基因工程技术构建ompL1/1和ompL1/2主要基因型原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rOmpL1/1和rOmpL1/2。采用胶体金免疫电镜技术,对OmpL1s进行膜定位。建立了基于rOmpL1s的ELISAs,检测钩体病人血清中特异性抗体水平及其类型。试验结果表明,黄疸出血群钩体仍然是四川地区最主要的优势钩体血清群。中国流行的钩体主要血清群ompL1基因可有ompL1/1和ompL1/2两个基因型,两者核苷酸和氨基酸序列相似性之间有较明显的差异。OmpL1s是位于钩体外膜表面的蛋白分子。不同稀释度的156例钩体病人血清标本中,rOmpL1/1和rOmpL1/2特异性IgM阳性率分别为67.9%～79.5%和75.0%～75.6%,特异性IgG阳性率分别为71.8%～79.5%和75.0%～76.9%。上述试验结果提示,OmpL1s是位于钩体表面属特异性蛋白抗原。自然感染钩体时,rOmpL1/1和rOmpL1/2均可诱导机体体液免疫应答并产生IgM和IgG两类血清抗体,且两者之间有广泛的抗原交叉反应。rOmpL1/1和rOmpL1/2可作为研制通用性钩体基因工程疫苗和检测试剂盒的候选抗原。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 ompL1基因 重组表达 分子定位 免疫应答
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问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析 被引量：4
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作者 罗冬娇 邱晓枫 +4 位作者 王江 严谨 王海斌 周金成 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期599-604,共6页
目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原... 目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量。采用免疫双扩散试验及WesternBlot,鉴定rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2的免疫原性。结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coliBL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2。表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78mg/L,是优化前的3.7倍。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号。结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号 抗原 细菌/分析 聚合酶链反应/方法 属特异性抗原 lipL32基 因/lipL21基因/OmpL1/2 融合基因/构建 原核表达 免疫原性/鉴定
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钩端螺旋体groEL基因原核表达及其产物免疫保护作用 被引量：4
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作者 李小余 王银环 +1 位作者 严杰 程东庆 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期164-170,共7页
目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株groEL基因原核重组表达系统,了解重组表达的GroEL蛋白(rGroEL)对金地鼠的免疫保护作用。方法:采用高保真PCR扩增问号钩体赖株groEL基因并测序,常规方法构建groEL基因原核表达系统... 目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株groEL基因原核重组表达系统,了解重组表达的GroEL蛋白(rGroEL)对金地鼠的免疫保护作用。方法:采用高保真PCR扩增问号钩体赖株groEL基因并测序,常规方法构建groEL基因原核表达系统。采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检查rGroEL表达情况及其可溶性,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL。观察rGroEL免疫金地鼠对问号钩体赖株感染的保护率。采用MAT法检测免疫动物血清与我国流行问号钩体血清群交叉凝集效价。结果:所克隆的groEL基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中相应基因完全相同。所构建的groEL基因原核表达系统能表达可溶性rGroEL。100和200μgrGroEL对金地鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%。rGroEL免疫金地鼠血清可不同程度地凝集各问号钩体血清群。结论:GroEL蛋白是问号钩体属特异性保护性抗原,可用于制备通用性钩体基因工程疫苗。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 GroEL蛋白质 遗传学 重组 遗传 基因表达 序列分析 DNA 免疫法 被动 groEL基因 原核表达 免疫保护
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