背景:微小RNA参与调控干细胞增殖、分化、衰老等过程,通过了解Let-7家族成员Let-7c对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响可以为干细胞移植治疗提供新思路。目的:探讨Let-7c慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化...背景:微小RNA参与调控干细胞增殖、分化、衰老等过程,通过了解Let-7家族成员Let-7c对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响可以为干细胞移植治疗提供新思路。目的:探讨Let-7c慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。方法:构建Let-7c上调及下调慢病毒载体并体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,筛选最适转染复数;实验分为未转染组、阴性转染组(转染空白慢病毒)、转染上调组(转染LV-rno-Let-7c-up)、转染下调组(转染LV-rno-Let-7c-5p-inhibition);采用法舒地尔诱导转染后的大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,倒置荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞转染后荧光表达,免疫细胞化学染色检测神经元标记物NSE和MAP-2的表达,RT-PCR检测MAP-2 m RNA的表达,MTT法检测细胞存活率。结果与结论:倒置荧光显微镜下观察大鼠LV-rno-Let-7c-up和LV-rno-Let-7c-5p-inhibition慢病毒载体转染成功。法舒地尔可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,与阴性转染组相比,转染上调组的诱导效率升高(P<0.05),NSE和MAP-2表达率上升(P<0.05),转染下调组的诱导效率下降,NSE和MAP-2表达率下降(P<0.05)。转染LV-rno-Let-7c-up后骨髓间充质干细胞经法舒地尔诱导向神经细胞分化比率增加,Let-7c可能具有促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。展开更多
目的研究SHARP-2（rat enhancer of split-and hairy-related protein-2）特异性基因沉默后对白细胞介素2（IL-2）和1干扰素（IFN-γ）基因表达及肾移植受者大鼠存活时间的影响。方法采用基因重组、转染、共转染等分子生物学方法将针对S...目的研究SHARP-2（rat enhancer of split-and hairy-related protein-2）特异性基因沉默后对白细胞介素2（IL-2）和1干扰素（IFN-γ）基因表达及肾移植受者大鼠存活时间的影响。方法采用基因重组、转染、共转染等分子生物学方法将针对SHARP-2的短发夹式RNA干扰序列导入到第3代自失活慢病毒载体Vira Power packaging mix，以构建重组慢病毒；有限稀释法确定病毒滴度；实时定量PCR法研究基因表达变化；原位大鼠肾移植模型研究SHARP-2基因沉默后受者存活时间变化。结果在正常大鼠肾脏细胞中，重组慢病毒LV-SHARP-2iC对SHARP-2的基因沉默效率达84％。在复感染指数（MOI）=20时，用spinoeulation法可使57％的T细胞受转染。在活化T细胞中，SHARP．2基因沉默后对IL-2和IFN-γ的基因表达抑制率分别达61．3％和68．7％。和空白对照以及随意序列对照组相比，5×10^7TUSHARP。2特异的RNA干扰重组慢病毒LV-SHARP-2iC灌注供肾后，肾移植受者大鼠的中位存活时间延长4～5d。移植肾局部组织分析发现SHARP-2基因沉默效果达61％，IL-2和IFN-γ的基因表达则分别下降了47．3％和58．2％。结论成功构建了以第3代自失活慢病毒为载体的、针对SHARP-2基因的短发夹式RNA干扰重组病毒LV—SHARP-2iC，该体系能使SHARP-2基因表达有效沉默，进而抑制活化T细胞中与排斥相关的IL-2和IFN-γ的基因表达，在肾移植模型中延长受者大鼠存活时间。展开更多
文摘背景:微小RNA参与调控干细胞增殖、分化、衰老等过程,通过了解Let-7家族成员Let-7c对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响可以为干细胞移植治疗提供新思路。目的:探讨Let-7c慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。方法:构建Let-7c上调及下调慢病毒载体并体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,筛选最适转染复数;实验分为未转染组、阴性转染组(转染空白慢病毒)、转染上调组(转染LV-rno-Let-7c-up)、转染下调组(转染LV-rno-Let-7c-5p-inhibition);采用法舒地尔诱导转染后的大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,倒置荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞转染后荧光表达,免疫细胞化学染色检测神经元标记物NSE和MAP-2的表达,RT-PCR检测MAP-2 m RNA的表达,MTT法检测细胞存活率。结果与结论:倒置荧光显微镜下观察大鼠LV-rno-Let-7c-up和LV-rno-Let-7c-5p-inhibition慢病毒载体转染成功。法舒地尔可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,与阴性转染组相比,转染上调组的诱导效率升高(P<0.05),NSE和MAP-2表达率上升(P<0.05),转染下调组的诱导效率下降,NSE和MAP-2表达率下降(P<0.05)。转染LV-rno-Let-7c-up后骨髓间充质干细胞经法舒地尔诱导向神经细胞分化比率增加,Let-7c可能具有促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。
文摘目的研究SHARP-2（rat enhancer of split-and hairy-related protein-2）特异性基因沉默后对白细胞介素2（IL-2）和1干扰素（IFN-γ）基因表达及肾移植受者大鼠存活时间的影响。方法采用基因重组、转染、共转染等分子生物学方法将针对SHARP-2的短发夹式RNA干扰序列导入到第3代自失活慢病毒载体Vira Power packaging mix，以构建重组慢病毒；有限稀释法确定病毒滴度；实时定量PCR法研究基因表达变化；原位大鼠肾移植模型研究SHARP-2基因沉默后受者存活时间变化。结果在正常大鼠肾脏细胞中，重组慢病毒LV-SHARP-2iC对SHARP-2的基因沉默效率达84％。在复感染指数（MOI）=20时，用spinoeulation法可使57％的T细胞受转染。在活化T细胞中，SHARP．2基因沉默后对IL-2和IFN-γ的基因表达抑制率分别达61．3％和68．7％。和空白对照以及随意序列对照组相比，5×10^7TUSHARP。2特异的RNA干扰重组慢病毒LV-SHARP-2iC灌注供肾后，肾移植受者大鼠的中位存活时间延长4～5d。移植肾局部组织分析发现SHARP-2基因沉默效果达61％，IL-2和IFN-γ的基因表达则分别下降了47．3％和58．2％。结论成功构建了以第3代自失活慢病毒为载体的、针对SHARP-2基因的短发夹式RNA干扰重组病毒LV—SHARP-2iC，该体系能使SHARP-2基因表达有效沉默，进而抑制活化T细胞中与排斥相关的IL-2和IFN-γ的基因表达，在肾移植模型中延长受者大鼠存活时间。
