L-2-氨基丁酸大肠杆菌生产菌株的构建 被引量：1

1

作者 王婷 韩超 +5 位作者 毛倩 张德志 蔡柠匀 刘宏亮 李燕军 陈宁 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期56-63,共8页

L-2-氨基丁酸作为新型药物的关键手性前体,在化工和制药行业应用广泛。该文以1株生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli) THRD为出发菌株,逐步延伸代谢途径,构建了L-2-氨基丁酸高产菌株。首先,分别把苏氨酸脱水酶编码基因ilv A2和ilv... L-2-氨基丁酸作为新型药物的关键手性前体,在化工和制药行业应用广泛。该文以1株生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli) THRD为出发菌株,逐步延伸代谢途径,构建了L-2-氨基丁酸高产菌株。首先,分别把苏氨酸脱水酶编码基因ilv A2和ilv A4在THRD中过表达,菌株THRD/p Trc99a-ilv A2在5 L发酵罐中分批补料发酵,2-酮基丁酸积累量达到18 g/L。然后,分别与ilv A2串联表达酪氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶编码基因tyr B、gdh和bcdBS,将L-2-酮基丁酸转化为L-2-氨基丁酸,菌株THRD/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量达到19 g/L。最后,研究了阻断L-苏氨酸输出途径对发酵的影响,菌株THRDΔrht C/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量提升至22 g/L。因此,通过代谢途径延伸可以有效地将L-苏氨酸生产菌株转变为L-2-氨基丁酸生产菌株。该研究为L-2-氨基丁酸高产菌株的构建奠定了基础,且对其他延伸代谢途径获得新产品的代谢工程研究提供了参考。 展开更多

关键词 大肠杆菌 l-苏氨酸 l-2-酮基丁酸 l-2-氨基丁酸 转运途径

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L-2-氨基丁酸生物合成研究进展 被引量：1

2

作者 潘苟生 郑仁朝 郑裕国 《发酵科技通讯》 CAS 2016年第3期182-187,共6页

生物法因为具有立体选择性高、环境污染少、反应条件温和等特点,已成为合成L-2-氨基丁酸的重要方法。对近年来生物法(包括发酵法、氨基酰化酶法、氨基酸氧化酶法、酰胺酶法、腈水解酶法、转氨酶法和氨基酸脱氢酶法)合成L-2-氨基丁酸的... 生物法因为具有立体选择性高、环境污染少、反应条件温和等特点,已成为合成L-2-氨基丁酸的重要方法。对近年来生物法(包括发酵法、氨基酰化酶法、氨基酸氧化酶法、酰胺酶法、腈水解酶法、转氨酶法和氨基酸脱氢酶法)合成L-2-氨基丁酸的路线和研究进展进行了综述,分析上述工艺中存在的问题并提出建议和对策,为实现L-2-氨基丁酸工业化生产和降低生产成本提供参考。 展开更多

关键词 左乙拉西坦 l-2-氨基丁酸 微生物发酵 生物催化

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亮氨酸脱氢酶催化底物偶联法合成α-酮异己酸

3

作者 丰险 穆晓清 +1 位作者 聂尧 徐岩 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2019年第4期698-704,共7页

构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系,打破氧化脱氨反应平衡,同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD^+的高效循环再生.基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数,考察了不同酮酸底物对于底物... 构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系,打破氧化脱氨反应平衡,同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD^+的高效循环再生.基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数,考察了不同酮酸底物对于底物偶联反应效率的影响,选择转化率最高的2-丁酮酸作为偶联底物,使α-KIC产率由单步氧化反应的2. 75%提高至66. 82%.通过考察底物浓度、pH值、NH_4^+浓度和辅酶NAD^+浓度等反应条件对偶联反应效率的影响,使α-KIC产率进一步提高至83. 25%,同时辅酶NAD^+的总转化数(TTN)达到5. 88×105.通过改变底物L-亮氨酸和2-丁酮酸的摩尔比,能够将α-KIC的产率进一步提高至92. 74%. 展开更多

关键词 亮氨酸脱氢酶 底物偶联 辅酶再生 α-酮异己酸 l-2-氨基丁酸

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大肠杆菌全细胞转化联产L-2-氨基丁酸和D-葡萄糖酸 被引量：5

4

作者 张蔡喆 杨套伟 +4 位作者 周俊平 郑俊贤 徐美娟 张显 饶志明 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期2028-2034,共7页

以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主,构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶(LTD,基因来源大肠杆菌)和共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶(GDH,来源枯草芽孢杆菌)的重组大肠杆菌,在此基础上,构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖... 以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主,构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶(LTD,基因来源大肠杆菌)和共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶(GDH,来源枯草芽孢杆菌)的重组大肠杆菌,在此基础上,构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-2-氨基丁酸(L-ABA)和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统。通过转化条件(温度、p H、细胞通透性和菌体量)优化,并采用分批补料策略,164 g/L L-苏氨酸和248 g/L D-葡萄糖最终转化得到141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸,时空得率分别达到7.1 g/(L?h)和13.5 g/(L?h),得率超过99%。本研究使用价格低廉的大宗化学品高效率生产出有较高附加值的产物,全细胞转化系统无需额外添加昂贵的辅酶,更适用于工业化生产。 展开更多

关键词 全细胞转化 l-2-氨基丁酸 D-葡萄糖酸 脱氨酶 脱氢酶

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三酶级联催化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸 被引量：4

5

作者 付妍 张君轩 +5 位作者 付雪蓉 解雨晨 任泓宇 刘佳 陈修来 刘立明 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期782-791,共10页

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种重要的化工原材料和手性医药中间体,为了实现L-ABA的高效生产,本研究在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中分别表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase,TD)、苏云金芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(... L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种重要的化工原材料和手性医药中间体,为了实现L-ABA的高效生产,本研究在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中分别表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase,TD)、苏云金芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LDH)和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase,FDH),构建体外级联酶催化反应实现L-苏氨酸向L-ABA的转化,体系中TD、LDH和FDH添加最适比例为1∶1∶0.2。为了简化生产工艺,将3种酶在一株菌E. coli 3FT+L中共表达并实现上述配比,在30 L发酵罐中用E. coli 3FT+L全细胞转化12 h,L-ABA的产量为68.5 g/L,底物L-苏氨酸的摩尔转化率达到99.0%。该工艺路线绿色高效,为未来大规模生产L-ABA提供借鉴。 展开更多

关键词 l-2-氨基丁酸 三酶级联 共表达重组菌 全细胞转化 l-苏氨酸

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点饱和突变提高腈水解酶不对称合成L-2-氨基丁酸的酶活 被引量：3

6

作者 周海岩 张旺 +2 位作者 徐建妙 柳志强 郑裕国 《工业微生物》 CAS CSCD 2015年第6期1-8,共8页

为了提高腈水解酶催化外消旋2-氨基丁腈不对称合成L-2-氨基丁酸的能力,首先从实验室的腈水解重组大肠杆菌中筛选获得了一株立体选择性较高的菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-28bbll6402。通过对其腈水解酶Nitbll6402进行三维结构同源模建和&q... 为了提高腈水解酶催化外消旋2-氨基丁腈不对称合成L-2-氨基丁酸的能力,首先从实验室的腈水解重组大肠杆菌中筛选获得了一株立体选择性较高的菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-28bbll6402。通过对其腈水解酶Nitbll6402进行三维结构同源模建和"热点"氨基酸分析,选择了6个位于"疏水口袋"附近的氨基酸残基(Y198、P239、P272、K251、E240和M234)进行点饱和突变,得到酶活力明显提高的突变型腈水解酶E240G和K251C。在60 mmol/L底物下,生成的L-2-氨基丁酸的e.e值均为100%,浓度分别为5.43 g/L和5.29 g/L,比原始酶分别提高了63%和59%。此结果表明,E240G或K251C的单点突变均能在不影响立体选择性的前提下不同程度的提高腈水解酶Nitbll6402合成L-2-氨基丁酸的能力,这将为利用腈水解酶催化合成L-2-氨基丁酸的进一步研究奠定重要的理论基础。 展开更多

关键词 腈水解酶 2-氨基丁腈 l-2-氨基丁酸 不对称合成 点饱和突变

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亮氨酸脱氢酶偶联NADH再生体系合成L-2-氨基丁酸 被引量：3

7

作者 张利坤 肖延铭 +4 位作者 杨卫华 华超 王云 李敬亚 杨套伟 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期992-1001,共10页

文中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,构建两株分别共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/甲酸脱氢酶(FDH,来源水生弯杆菌)和亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/醇脱氢酶(ADH,来源红球菌)的重组大肠杆菌。通过偶联两种不同NADH再生体... 文中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,构建两株分别共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/甲酸脱氢酶(FDH,来源水生弯杆菌)和亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/醇脱氢酶(ADH,来源红球菌)的重组大肠杆菌。通过偶联两种不同NADH再生体系,以L-苏氨酸为起始原料,利用苏氨酸脱氨酶(L-TD)与LDH-FDH或LDH-ADH一锅法合成L-2-氨基丁酸,并对LDH-FDH工艺和LDH-ADH工艺进行对比优化。LDH-FDH工艺的最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃,通过加入50 g/L甲酸铵、0.3 g/L NAD^+、10%LDH-FDH粗酶液(V/V)和7500 U/L的L-TD酶液,对L-苏氨酸进行分批补加,以便控制2-丁酮酸浓度小于15 g/L,反应28 h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为161.8 g/L,产率97%。LDH-ADH工艺的最适pH为8.0,最适反应温度为35℃,通过加入0.3 g/L NAD^+、10%LDH-ADH粗酶液(V/V)及7500 U/L的L-TD酶液,分批补加L-苏氨酸及1.2倍摩尔量异丙醇,以便控制2-丁酮酸浓度小于15 g/L,且每生成约40 g/L的L-2-氨基丁酸,抽真空去除丙酮,反应24 h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为119.6 g/L,产率98%。文中所采用的工艺及结果可为L-2-氨基丁酸的工业化提供一定的参考依据。 展开更多

关键词 共表达 l-2-氨基丁酸 生物催化 NADH再生

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亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶共表达菌株发酵产酶条件优化及其在L-2-氨基丁酸合成中的应用 被引量：3

8

作者 徐建妙 陈策 +1 位作者 张博 柳志强 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期29-35,共7页

亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸需要辅酶NADH参与,构建 Escherichia coli (LeuDH/FDH),通过共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶实现了辅酶NADH胞内循环再生。通过产酶条件优化,提高该菌株催化制备L-2-氨基丁酸的效率。结果表明,... 亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸需要辅酶NADH参与,构建 Escherichia coli (LeuDH/FDH),通过共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶实现了辅酶NADH胞内循环再生。通过产酶条件优化,提高该菌株催化制备L-2-氨基丁酸的效率。结果表明,在5L发酵罐上,在诱导温度为22 ℃、诱导剂乳糖质量浓度为 8.0 g/L 和诱导时间为17 h的条件下,亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活分别达到79.2 U/g和216.1 U/g,催化效果最佳。利用该菌株全细胞为催化剂,耦合苏氨酸脱氨酶,在1L反应体系中进行了催化反应, L -苏氨酸质量浓度为180 g/L时,无需额外添加辅酶,8 h反应后底物转化率达到99%,L-2-氨基丁酸 e.e.值99.5%以上,时空产率19.3 g/(L·h)。该研究为建立高效、低成本的L-2-氨基丁酸工业化生产方法提供了基础。 展开更多

关键词 l-2-氨基丁酸 亮氨酸脱氢酶 甲酸脱氢酶 共表达 优化

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偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法酶催化合成L-2-氨基丁酸 被引量：3

9

作者 刘珊 李元 祝俊 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期64-70,共7页

以廉价易得的L-苏氨酸为原料,利用在大肠杆菌中重组表达的苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶,并偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法制备L-2-氨基丁酸。以L-2-氨基丁酸的产率为指标,考察了一锅法酶催化制备L-2-氨基丁酸的最适p H、L-苏氨酸... 以廉价易得的L-苏氨酸为原料,利用在大肠杆菌中重组表达的苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶,并偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法制备L-2-氨基丁酸。以L-2-氨基丁酸的产率为指标,考察了一锅法酶催化制备L-2-氨基丁酸的最适p H、L-苏氨酸浓度及异丙醇浓度。在最适p H 7.5~8.0,L-苏氨酸浓度50g/L,添加5%的异丙醇及0.5g/L NAD+,分别加入0.6g/L苏氨酸脱氨酶、2g/L亮氨酸脱氢酶及2g/L酮还原酶,反应20h,可实现L-2-氨基丁酸的摩尔产率为99%,产量为43g/L。该结果为L-2-氨基丁酸的制备提供了一种新的思路。 展开更多

关键词 酶催化 l-2-氨基丁酸 NADH再生 一锅法

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亮氨酸脱氢酶C端Loop区域的理性设计及多酶级联高效合成L-2-氨基丁酸 被引量：2

10

作者 陈佳杰 徐美娟 +4 位作者 杨套伟 张显 邵明龙 李华钟 饶志明 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期4254-4265,共12页

亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctu... 亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)值,对其波动非常明显的Loop区域合理设计以得到比酶活提高的截短突变体EsLDHD2,其比酶活为野生型的123.2%;此外,由于L-2-氨基丁酸制备过程中苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸制备2-酮丁酸的速率过快导致多酶催化不平衡,因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率,构建多酶级联催化的单细胞E.coliBL21/pACYCDuet-RM,其摩尔转化率相较于E.coliBL21/pACYCDuet-RO提高74.6%;对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM的全细胞转化条件进行优化,其最适pH、温度、底物浓度分别为7.5、35℃和80 g/L,此时摩尔转化率大于99%;在1 L转化体系和最适转化条件下分批加入L-苏氨酸80 g和40 g,L-2-氨基丁酸的产量达97.2g。总之,该策略为L-2-氨基丁酸的制备提供了绿色、高效的合成方法,具有工业化制备药物前体的巨大潜力。 展开更多

关键词 亮氨酸脱氢酶 l-2-氨基丁酸 loop区域 多酶级联催化 全细胞转化

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过量表达甲酸脱氢酶提高大肠杆菌合成L-2-氨基丁酸的效率

11

作者 李莹 史红玲 +3 位作者 王喆 冉璐妮 薛闯 唐存多 《精细化工》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1048-1054,1072,共8页

为了实现L-2-氨基丁酸(L-ABA)的高效生物合成,借助pACYCDuet-1和pET28a共表达系统,构建了携带L-苏氨酸脱氨酶(L-TD)、L-亮氨酸脱氢酶(L-L-DH)和不同活性甲酸脱氢酶(FDH)编码基因的重组大肠杆菌,分别命名为:E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1... 为了实现L-2-氨基丁酸(L-ABA)的高效生物合成,借助pACYCDuet-1和pET28a共表达系统,构建了携带L-苏氨酸脱氨酶(L-TD)、L-亮氨酸脱氢酶(L-L-DH)和不同活性甲酸脱氢酶(FDH)编码基因的重组大肠杆菌,分别命名为:E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-Ec TD-Es LeuDH:pET28a-Cb FDH和E.coli BL21(DE3)/p ACYCDuet-1-Ec TD-Es Leu DH:p ET28a-Cb FDH^(M)。经诱导表达后,L-苏氨酸脱氨酶和L-亮氨酸脱氢酶在两个重组大肠杆菌中的表达水平基本一致,而后者的甲酸脱氢酶酶活表达水平为(342.00±9.40)IU/mL,显著高于前者的(196.00±6.20)IU/mL。在50 mL反应体系中,200 mmol/L L-苏氨酸经220 r/min、30℃下反应6 h时,前者L-ABA得率为71%,后者为85%。结果表明,提高甲酸脱氢酶的表达水平可以显著提高L-ABA的合成效率。此外,优化反应温度后,在35℃下反应6 h时,L-ABA的得率可达90%。 展开更多

关键词 l-2-氨基丁酸 l-苏氨酸 共表达 微生物细胞工厂 全细胞催化 生物工程

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甲酸脱氢酶外源表达发酵条件优化及在L-2-氨基丁酸合成中的应用 被引量：1

12

作者 徐建妙 赵哲 +1 位作者 陈策 柳志强 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期63-68,共6页

采用摇瓶对重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET28b-FDH外源表达甲酸脱氢酶发酵条件进行优化。结果表明,当诱导温度22℃,诱导剂IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间16 h条件下,可溶性目的蛋白表达量为52.12 mg/g,相对于优化前的40.12 ... 采用摇瓶对重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET28b-FDH外源表达甲酸脱氢酶发酵条件进行优化。结果表明,当诱导温度22℃,诱导剂IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间16 h条件下,可溶性目的蛋白表达量为52.12 mg/g,相对于优化前的40.12 mg/g,提高了29.91%。在此基础上,在5 L发酵罐上对外源表达甲酸脱氢酶发酵条件进行优化。结果表明,当诱导温度22℃,诱导剂乳糖质量浓度8 g/L,诱导时间16 h条件下可溶性目的蛋白表达量为41.26 mg/g,相对于优化前的34.15 mg/g提高了20.82%。利用该条件下培养的菌体经破碎后获得甲酸脱氢酶粗酶液与适当比例的苏氨酸脱氨酶及亮氨酸脱氢酶粗酶液进行匹配,在底物L-苏氨酸质量浓度为180 g/L,辅底物甲酸铵120 g/L,NAD^+0.1 g/L,在1 L反应体系中,恒温水浴35℃,搅拌转速500 r/mim条件下,反应9 h后,底物转化率达99%以上,时空产率17.2 g/(L·h),e.e.值99.5%以上。 展开更多

关键词 甲酸脱氢酶 发酵条件 优化 l-2-氨基丁酸

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用于合成L-2-氨基丁酸基因工程菌的构建 被引量：1

13

作者 郭红颜 梁蕊 +2 位作者 李航 陈代杰 邵雷 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1076-1079,共4页

构建了还原型辅酶Ⅰ(NADH)再生与亮氨酸脱氢酶(LDH)偶联的催化体系,合成甲酸脱氢酶(FDH)基因序列片段,连接入pET28a质粒,构建了pFDH-pET28a,转化入E.coli BL21(DE3)表达。经IPTG诱导后,FDH粗酶液的酶活力约10 u/ml。合成LDH基因序列,连... 构建了还原型辅酶Ⅰ(NADH)再生与亮氨酸脱氢酶(LDH)偶联的催化体系,合成甲酸脱氢酶(FDH)基因序列片段,连接入pET28a质粒,构建了pFDH-pET28a,转化入E.coli BL21(DE3)表达。经IPTG诱导后,FDH粗酶液的酶活力约10 u/ml。合成LDH基因序列,连接入pET21a质粒,构建了pLDH-p ET21a,将该质粒与pFDH-pET28a共转化入E.coli BL21(DE3),共表达FDH与LDH,与苏氨酸脱氨酶(TD)共同催化L-2-氨基丁酸的合成。投料量为7 g/100 ml时,该体系产率可达95%。 展开更多

关键词 还原型辅酶Ⅰ 甲酸脱氢酶 亮氨酸脱氢酶 共表达 l-2-氨基丁酸

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