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K88菌毛蛋白亚基基因克隆、表达及重组蛋白抗血清制备 被引量：8
1
作者 赵主江 黄诚 +5 位作者 黄亚红 陈建秀 周智爱 梁婉琪 潘爱虎 张大兵 《上海农业学报》 CSCD 2000年第2期38-41,共4页
利用 PCR技术 ,从仔猪黄痢的致病菌中扩增出不含信号肽序列的 K88菌毛蛋白亚基基因片段 ,将其克隆到 E.coli表达载体 p ET2 8a(+)中 ,构建了该基因的原核表达载体 p882 8,导入 E.coli BL 2 1(DE3) ,得到工程菌株。 SDS- PAGE分析结果显... 利用 PCR技术 ,从仔猪黄痢的致病菌中扩增出不含信号肽序列的 K88菌毛蛋白亚基基因片段 ,将其克隆到 E.coli表达载体 p ET2 8a(+)中 ,构建了该基因的原核表达载体 p882 8,导入 E.coli BL 2 1(DE3) ,得到工程菌株。 SDS- PAGE分析结果显示 ,经 IPTG诱导 ,该亚基基因高效表达出重组 K88菌毛蛋白 ,约占菌体总蛋白的 30 %。用含重组蛋白的凝胶作为抗原 ,免疫新西兰大白兔 ,首次制备 K88菌毛蛋白亚基的抗血清。免疫学分析表明 。 展开更多
关键词 ETEC k88菌毛蛋白 抗血清 大肠杆菌
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共表达ETECK99、K88菌毛蛋白重组干酪乳杆菌的构建 被引量：4
2
作者 温丽娟 王桂华 +2 位作者 侯喜林 余丽芸 王萌 《黑龙江八一农垦大学学报》 2011年第3期34-39,共6页
将PCR扩增的K99和K88-LTB基因片段串联插入到干酪乳杆菌细胞表面表达载体pLA中,构建了重组表达载体pLA-K99-K88-LTB,将其电转化干酪乳杆菌CICC 6 105,获得了表达融合蛋白pLA-K99-K88-LTB的重组干酪乳杆菌表达系统。重组干酪乳杆菌在MRS... 将PCR扩增的K99和K88-LTB基因片段串联插入到干酪乳杆菌细胞表面表达载体pLA中,构建了重组表达载体pLA-K99-K88-LTB,将其电转化干酪乳杆菌CICC 6 105,获得了表达融合蛋白pLA-K99-K88-LTB的重组干酪乳杆菌表达系统。重组干酪乳杆菌在MRS培养基中表达后,经SDS-PAGE检测,约有90 KDa的融合蛋白得到表达,蛋白大小与理论值相符合。Western-blot分析表明表达的蛋白可被鼠源K99,K88抗血清所识别。间接免疫荧光技术和流式细胞术的结果表明,融合蛋白成功地利用多聚谷氨酸跨膜蛋白pgsA基因展示在干酪乳杆菌菌体表面。 展开更多
关键词 产肠毒素性大肠杆菌 k88菌毛蛋白 k99菌毛蛋白 干酪乳杆菌
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ETEC K99、K88菌毛蛋白抗原表位多肽的设计合成及免疫反应 被引量：1
3
作者 余丽芸 田斌 +6 位作者 温丽娟 王桂华 曹宁 魏小曼 郭东伟 齐浩 刘秋晨 《江西农业学报》 CAS 2013年第3期88-92,共5页
目的:通过生物信息学及蛋白分析软件等,寻找ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位。方法:通过生物信息学技术、DNAStar Protean蛋白分析软件及网络共享软件对ETEC K88、K99菌毛蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计ETEC K88、K99菌毛... 目的:通过生物信息学及蛋白分析软件等,寻找ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位。方法:通过生物信息学技术、DNAStar Protean蛋白分析软件及网络共享软件对ETEC K88、K99菌毛蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位多肽;采用腹腔注射的方式将合成的抗原表位多肽免疫小鼠,用ELISA法检测血清中产生的抗体,并对免疫小鼠进行了攻毒试验。结果:多肽免疫小鼠后均能诱导抗体产生,攻毒试验表明合成肽对小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。 展开更多
关键词 ETEC k99菌毛蛋白 ETEC k88菌毛蛋白 抗原表位 合成肽
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产肠毒素大肠杆菌K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位的原核表达及其鼻腔免疫效果 被引量：1
4
作者 姜柯安 贺志良 +1 位作者 宋方洲 马永平 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第9期1091-1094,共4页
目的原核表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)b亚单位(LTb),并评价其鼻腔免疫效果。方法采用PCR技术分别扩增不含信号肽的K88和LTb基因,克隆... 目的原核表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)b亚单位(LTb),并评价其鼻腔免疫效果。方法采用PCR技术分别扩增不含信号肽的K88和LTb基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达的重组K88和LTb蛋白纯化、复性后,进行SDS-PAGE分析。分别用K88单独、K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠,以生理盐水作为对照,每次间隔1周,共4次,末次免疫后10 d,分离血清,并收集鼻腔和小肠黏膜冲洗液,间接ELISA法检测各组血清特异性IgG和黏膜sIgA抗体水平。结果重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组K88和LTb蛋白相对分子质量分别为28 100和12 500,表达量分别约占菌体总蛋白的35%和40%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度均可达95%以上。K88联合LTb滴鼻免疫组血清特异性IgG及鼻腔、小肠黏膜冲洗液中特异性SIgA水平均较K88单独免疫组和对照组明显增高,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论在大肠杆菌中高效表达并纯化了重组K88和LTb蛋白,K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠后,可增强特异性血清抗体反应,且诱导了黏膜免疫应答,为将来开发新型的ETEC基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 产肠毒素大肠杆菌 k88菌毛蛋白 大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位 原核细胞 基因表达 黏膜免疫
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大肠杆菌K88菌毛蛋白发酵工艺的初步研究
5
作者 杨春梅 《生命科学研究》 CAS CSCD 2006年第S2期72-77,共6页
采用液体培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基和强化营养肉汤培养基对大肠杆菌K88进行发酵培养,采用不同摇瓶培养时间和不同pH值的培养基观察发酵结果,研究菌体和菌毛生产量的相关性,并通过紫外分光光度计UV751于600nm处测量菌体OD值以对菌种... 采用液体培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基和强化营养肉汤培养基对大肠杆菌K88进行发酵培养,采用不同摇瓶培养时间和不同pH值的培养基观察发酵结果,研究菌体和菌毛生产量的相关性,并通过紫外分光光度计UV751于600nm处测量菌体OD值以对菌种发酵情况进行检测.热激分离菌体和菌毛蛋白,(NH4)2SO4盐析分离纯化K88菌毛蛋白并用分光光度计于280nm处测定其OD值.透析后经SDSP-AGE检测菌毛蛋白纯度.根据实验结果优化发酵培养条件,确定菌种的最佳发酵工艺,以收获最多的K88菌毛蛋白.经过实验研究,最终确定了大肠杆菌K88在pH值为6.5、转速为250r/min的条件下发酵18个h,菌体和菌毛生产量均达到高峰,同时得出菌毛蛋白和菌体成正相关. 展开更多
关键词 大肠杆菌 k88菌毛蛋白 发酵 工艺优化
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猪产肠毒素性大肠杆菌野生株K88菌毛蛋白结构基因的克隆与序列测定 被引量：2
6
作者 李鹏 戴鼎震 +1 位作者 陈焕春 金升藻 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期198-202,共5页
根据报道的猪产肠毒素性大肠杆菌K88菌毛结构基因DNA序列 ,在其保守区用Goldkey软件设计了 1对引物 ,经PCR扩增从 2 0株野生分离株质粒中得到 17个大小在 815bp左右的阳性产物 ,经纯化、连接、转化、筛选及核酸序列测定与分析 ,确认所... 根据报道的猪产肠毒素性大肠杆菌K88菌毛结构基因DNA序列 ,在其保守区用Goldkey软件设计了 1对引物 ,经PCR扩增从 2 0株野生分离株质粒中得到 17个大小在 815bp左右的阳性产物 ,经纯化、连接、转化、筛选及核酸序列测定与分析 ,确认所克隆的外源基因与报道的K88菌毛 (亚单位K88ab、K88ac、K88ad)蛋白结构基因序列一致 。 展开更多
关键词 k88菌毛蛋白结构基因 克隆 序列测定
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大肠埃希菌K88ac菌毛蛋白亚基因的原核表达及其免疫原性研究 被引量：1
7
作者 李国军 侯喜林 朴范泽 《动物医学进展》 CSCD 2007年第8期1-4,共4页
从E.coliC83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coliXL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达。Western blot结果显示,表达... 从E.coliC83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coliXL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达。Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。 展开更多
关键词 产肠毒素大肠埃希菌 k88ac菌毛蛋白 表达 免疫原性
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大肠杆菌k_(88)ac菌毛蛋白亚基因的克隆、表达及亲和层析纯化
8
作者 李国军 侯喜林 《黑龙江八一农垦大学学报》 2007年第4期58-62,共5页
利用PCR技术,从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中。经IPTG诱导后,由T5启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残... 利用PCR技术,从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中。经IPTG诱导后,由T5启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的以包涵体形式存在的K88ac蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化,并获得了高纯度的融合蛋白。 展开更多
关键词 ETEC k88ac菌毛蛋白 表达 纯化
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