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pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化 被引量:12
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作者 姚玲玲 王家宁 +1 位作者 黄永章 郭凌郧 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期1319-1325,共7页
目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带SalI和BglII酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDN... 目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带SalI和BglII酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3'末端加“A”并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasyVector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeI和XhoI酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalI-BglII和XhoI-BamHI双酶切,利用同尾酶(SalI与XhoI,BglII与BamHI)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1-CAT重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”(His-tag)对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U/g。结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。 展开更多
关键词 原核表达 过氧化氢酶 TA克隆 同尾酶 融合蛋白
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同尾酶技术在构建疟疾多价重组DNA疫苗中的应用 被引量:8
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作者 林澄涛 姜燕芳 +3 位作者 阴彬 董敏 何湘云 王恒 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第6期974-977,共4页
同尾酶是一类识别不同核苷酸序列但能酶切产生相同粘性末端的限制性内切酶,依靠同尾酶的这种特性,可以根据需要将不同的DNA 片段进行灵活组合,获得各种排列顺序的多价表位重组疫苗.将这种方法用于疟疾多价重组DNA 疫苗的研制... 同尾酶是一类识别不同核苷酸序列但能酶切产生相同粘性末端的限制性内切酶,依靠同尾酶的这种特性,可以根据需要将不同的DNA 片段进行灵活组合,获得各种排列顺序的多价表位重组疫苗.将这种方法用于疟疾多价重组DNA 疫苗的研制;BALB/c 小鼠免疫实验对所得重组疫苗PU286的免疫原性进行了测定. 展开更多
关键词 疟疾 多价重组疫苗 同尾酶 DNA疫苗
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利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒 被引量:9
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作者 姚玲玲 王家宁 +1 位作者 黄永章 郭凌郧 《郧阳医学院学报》 2006年第1期1-5,F0002,共6页
目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长... 目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。 展开更多
关键词 同尾酶 过氧化氢酶 TA克隆 DNA重组 PEP-1肽
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基于同尾酶技术构建CCL3L1基因串联重组质粒的方法 被引量:4
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作者 乔录新 张世杰 +1 位作者 石英 陈德喜 《现代生物医学进展》 CAS 2012年第2期239-241,234,共4页
目的:利用同尾酶技术将CCL3L1基因重复连续插入pcDNA6.2-GW/miR载体,构建含有CCL3L1基因串联体的重组质粒,实现小片段CCL3L1有效延长。方法:PCR扩增CCL3L1基因并在引物的两端设有同尾酶BamHI和BglII限制性内切酶位点,纯化PCR产物插入pMD... 目的:利用同尾酶技术将CCL3L1基因重复连续插入pcDNA6.2-GW/miR载体,构建含有CCL3L1基因串联体的重组质粒,实现小片段CCL3L1有效延长。方法:PCR扩增CCL3L1基因并在引物的两端设有同尾酶BamHI和BglII限制性内切酶位点,纯化PCR产物插入pMD18-T载体,阳性克隆命名为pMD18T-CCL3L1。BamHI和BglII双酶切pMD18T-CCL3L1和pcDNA6.2-GW/miR载体后将第一个CCL3L1片段插入pcDNA6.2-GW/miR载体命名为pcDNA6.2-CCL3L1-1。由于载体本身在BglII位点后带有XhoI酶切位点利用BamHI和XhoI切割pcDNA6.2-CCL3L1-1回收CCL3L1片段,BglII和XhoI切割pcDNA6.2-CCL3L1-1回收大片段做载体重组形成含有两个连续CCL3L1片段的质粒命名为pcDNA6.2-CCL3L1-2,重复此步骤可得到含有N个CCL3L1基因串联体的重组质粒pcDNA6.2-CCL3L1-X。结果:经酶切和测序证实成功构建含有4个CCL3L1基因串联体的重组质粒pcDNA6.2-CCL3L1-4,并同时产生含有1个和2个CCL3L1基因串联体的重组质粒。结论:利用同尾酶技术可以快速有效地构建CCL3L1基因串联重组质粒,实现目的片段的无限扩大,为小片段基因表达的研究奠定基础。 展开更多
关键词 同尾酶 CCL3L1 基因串联
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疏水性ELP基因设计与基因库构建 被引量:4
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作者 林衡 李军明 +3 位作者 张立超 葛高顺 许崇波 胡学军 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期584-592,共9页
【目的】设计合成疏水性类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)基因,建立ELP基因库。【方法】选择疏水性最强的异亮氨酸(Ile,I)(疏水参数:4.5)取代ELP五肽重复序列单元(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-客座氨基酸-甘氨酸,VPGXG)中客座残基X... 【目的】设计合成疏水性类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)基因,建立ELP基因库。【方法】选择疏水性最强的异亮氨酸(Ile,I)(疏水参数:4.5)取代ELP五肽重复序列单元(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-客座氨基酸-甘氨酸,VPGXG)中客座残基X。全基因合成一段含编码(VPGIG)10序列,上游含DraⅢ酶切位点、下游含BglⅠ酶切位点的ELP单元。将DraⅢ和BglⅠ设计为一对同尾酶(Isocaudarner),利用这对同尾酶定向克隆(Recursive directional ligation,RDL)一系列不同拷贝数的ELP基因。为鉴定基因库有效性,随机选取库中ELP[I]50基因进行蛋白表达、纯化并测定其相变温度(Inverse temperaturetransition,Tt)。【结果】建立了ELP[I]n(n=10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120)基因库。测定ELP[I]50的Tt为24.3°C。【结论】首次单独选用Ile(I)作为ELP蛋白质标签中客座残基氨基酸,增加了ELP中疏水性氨基酸的含量,为进一步筛选出表达量高、Tt低、分子量小的ELP标签奠定基础。 展开更多
关键词 类弹性蛋白 异亮氨酸 同尾酶 定向克隆
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多肽基因串联体构建技术 被引量:2
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作者 刘宝全 王剑锋 范圣第 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第16期8345-8346,共2页
[目的]建立一种快速构建多肽基因串联体的方法。[方法]在多肽基因两侧加入同尾酶识别位点,利用同尾酶形成的粘性末端连接后不能被原酶识别与切割的特点,有效构建基因串联体。[结果]利用化学法合成的人表皮生长因子基因,有效构建并获得... [目的]建立一种快速构建多肽基因串联体的方法。[方法]在多肽基因两侧加入同尾酶识别位点,利用同尾酶形成的粘性末端连接后不能被原酶识别与切割的特点,有效构建基因串联体。[结果]利用化学法合成的人表皮生长因子基因,有效构建并获得多肽基因的二联体与三联体。[结论]利用同尾酶技术,可以快速有效地构建基因串联体。 展开更多
关键词 基因串联体 同尾酶 人表皮生长因子
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番茄CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术体系构建与应用 被引量:3
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作者 杨孟霞 刘晓林 +12 位作者 曹雪 魏凯 宁宇 杨沛 李珊珊 陈紫月 王孝宣 国艳梅 杜永臣 李君明 刘磊 李鑫 黄泽军 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期1215-1229,共15页
为了构建番茄CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系,用SlU6-2p、SlU6-3p、SlU6-7p、SlU3-5p、SlU3-9p和SlU6-5p启动子分别替换pKSE401和pCBC-DT1T2载体中的拟南芥U6启动子,构建了1个双元载体(p MGET)、2个中间载体(pKC-S2M和pKC-S3M)和3个g... 为了构建番茄CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系,用SlU6-2p、SlU6-3p、SlU6-7p、SlU3-5p、SlU3-9p和SlU6-5p启动子分别替换pKSE401和pCBC-DT1T2载体中的拟南芥U6启动子,构建了1个双元载体(p MGET)、2个中间载体(pKC-S2M和pKC-S3M)和3个gRNA模块载体(pCBC-S1、pCBC-S2和pCBC-S3)。为了测试该多基因编辑体系,通过PCR扩增、Goldengate克隆和同尾酶技术,将含有6个番茄果实性状相关基因Green flesh(GF)、Ovate(O)、Locule number(LC)、SlMYB12(Y)、Tangerine(T)、Uniformripening(U)靶点序列的sgRNA聚合构建多基因编辑载体pMGET-OYGTULC和pMGET-TULCOYG,检测6个基因同时被编辑的效率分别为44.00%和11.76%。用携带pMGET-OYGTULC载体的根癌农杆菌转化番茄材料获得2株6个基因均被编辑的植株,序列变异为单个碱基的插入、单个或多个碱基的缺失及大片段的缺失等多种形式。本研究中该多基因编辑体系可以高效地应用于番茄多基因编辑,并且可以得到稳定遗传的突变体,可为番茄基础研究和遗传改良提供一个简便的工具箱。 展开更多
关键词 番茄 CRISPR/Cas9 多基因编辑 U3 snRNA基因 同尾酶技术 GFP标记基因 果实性状
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羊抑制素α亚基N端1-33序列肽段多聚体的构建及其表达纯化 被引量:2
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作者 黄运茂 施振旦 +1 位作者 于迎春 邵西兵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期311-314,共4页
为了提高短肽的免疫原性以制备短肽基因工程疫苗 ,将羊抑制素α亚基N端 1_33氨基酸残基片段的基因序列插入表达质粒pRSET A的BamHⅠ \SacⅠ位点之间构建重组质粒pR INH ,然后利用质粒中的一对同尾酶位点BamHⅠ \BglⅡ和下游的另一酶切位... 为了提高短肽的免疫原性以制备短肽基因工程疫苗 ,将羊抑制素α亚基N端 1_33氨基酸残基片段的基因序列插入表达质粒pRSET A的BamHⅠ \SacⅠ位点之间构建重组质粒pR INH ,然后利用质粒中的一对同尾酶位点BamHⅠ \BglⅡ和下游的另一酶切位点HindⅢ ,经过简单的酶切后 ,将产物按各种组合连接 ,构建了抑制素串联 2至 6聚体基因。含 3至 6聚体基因的重组质粒pR 3INH、pR 4INH、pR 5INH和pR 6INH经IPTG诱导均能在大肠杆菌 (E .coli)BL2 1(DE3)中表达目的蛋白 ,分别占菌体蛋白的 6 %、6 %、7%和 8% ,且都以包涵体形式存在。结果说明 ,利用同尾酶切技术可以快速正确地构建短肽片段的串联多聚体重组质粒 ,为构建短肽半抗原的高免疫原性基因工程疫苗提供了新的思路。 展开更多
关键词 抑制素 同尾酶 串联多聚体 表达
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利用三引物PCR和同尾酶连接的策略实现多基因片段的重组
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作者 马艺沔 毛国红 +1 位作者 汤文强 宋水山 《河北省科学院学报》 CAS 2004年第3期57-61,共5页
在构建质外体CaM结合小肽中间载体的过程中,采用了三引物PCR和同尾酶连接法进 行DNA重组,构建了SLR1 BPs信号肽 CaN Cmyc的融合基因的一连体和CaN二连体。结果表 明,三引物PCR方法对多个小基因片段的重组操作方便快速,比酶切、连接... 在构建质外体CaM结合小肽中间载体的过程中,采用了三引物PCR和同尾酶连接法进 行DNA重组,构建了SLR1 BPs信号肽 CaN Cmyc的融合基因的一连体和CaN二连体。结果表 明,三引物PCR方法对多个小基因片段的重组操作方便快速,比酶切、连接方法更具优越性。 而同尾酶连接方法是连接多拷贝基因的有效方法。 展开更多
关键词 质外体CaM 三引物PCR法 同尾酶连接 DNA重组
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Effects of the configuration of a multi epitope chimeric malaria DNA vaccine on its antigenicity to mice 被引量:1
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作者 姜艳芳 林澄涛 +7 位作者 阴彬 何湘芸 毛映红 董敏 徐蓓 张连惠 刘宝丰 王恒 《Chinese Medical Journal》 SCIE CAS CSCD 1999年第8期14-18,共5页
Objective Four B and Th cell epitopes were selected from conservative domain of Plasmodium falciparum antigens to construct two groups of chimeric malaria DNA vaccines with different configurations and their antigeni... Objective Four B and Th cell epitopes were selected from conservative domain of Plasmodium falciparum antigens to construct two groups of chimeric malaria DNA vaccines with different configurations and their antigenicities were studied Methods The partially synthesized oligonucleotide was annealed, PCR amplified and cloned into a mammalian cell expression vector By using a pair of isocaudamers on the vector, different single copies of B epitopes were multiplied and were tenderly stringed into two groups of chimeric DNA vaccine with different configurations BALB/c mice were immunized with these DNA plasmids by either intramuscular or intradermal injections Results The antisera from the immunized mice tested by ELISA showed that only the configuration which had a single copy of universal T helper cell epitope, CS T3, located at the C terminal of the multi copy B cell epitopes induced a high antibody response The T helper cell epitope at any other position of the peptide, or the double T helper cell epitopes configured with the B cell epitopes did not enhance antibody response, and some configurations even decreased the humoral response to a B cell epitope Conclusion This study demonstrated that both combination and configuration of the epitope may affect the antigenicity of a chimeric multiple antigen 展开更多
关键词 malaria · Plasmodium falciparum · epitopes · DNA vaccine · isocaudamers
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