人乳头瘤病毒52型L1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的优化表达、纯化及其免疫原性 被引量：3

1

作者 仝光杰 王文伟 +3 位作者 蔡蓓蓓 王蓓 胡海涛 楼觉人 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第12期1336-1342,共7页

目的 利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的免疫原性。方法 采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构... 目的 利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的免疫原性。方法 采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构建多拷贝表达质粒,经转化和筛选获得在毕赤酵母系统中高表达的HPV52 L1 VLP菌种。采用15 L发酵罐大规模培养,菌液破碎上清经阳离子交换层析和分子筛排阻层析两步法纯化,获得HPV52 L1VLP。动态光散射和透射电子显微镜观察HPV52 L1 VLP的大小和形态,假病毒中和试验检测HPV52 L1 VLP在小鼠及大鼠体内的免疫原性。结果 HPV52 L1 VLP在溶液中呈较均一的单一组分,水合粒径为91. 37 nm;镜下观察呈均一的、直径约50 nm的球状空心颗粒,大小与HPV52天然病毒颗粒相近。HPV52 L1 VLP相对分子质量约56 000,纯度达95%以上,产量为3. 6 mg/L,且可与小鼠抗HPV L1多克隆单抗发生特异性结合。HPV52 L1 VLP在小鼠体内的半数有效剂量(ED50)为0. 010μg,在大鼠体内诱导产生的中和抗体滴度高达106。结论 于毕赤酵母系统成功表达了HPV52 L1 VLP,且具有良好的免疫原性,为相关预防性疫苗的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 人乳头瘤病毒52型 L1蛋白 病毒样颗粒 毕赤酵母 免疫原性

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猪主动脉脱细胞基质的简化制备及生物学评价 被引量：10

2

作者 张建 吴英锋 陈亮 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期364-369,共6页

目的应用酶法制备猪主动脉脱细胞基质,并评价其生物学性能。方法取新鲜屠宰的16根肉猪降主动脉,长10～12cm,应用0.1%胰蛋白酶和0.01%EDTA于37℃震荡条件下脱除细胞成分,HE和Masson染色行脱细胞基质的组织学观察,扫描电镜和透射电镜观察... 目的应用酶法制备猪主动脉脱细胞基质,并评价其生物学性能。方法取新鲜屠宰的16根肉猪降主动脉,长10～12cm,应用0.1%胰蛋白酶和0.01%EDTA于37℃震荡条件下脱除细胞成分,HE和Masson染色行脱细胞基质的组织学观察,扫描电镜和透射电镜观察超微结构改变。应用单轴拉伸方法比较脱细胞前和脱细胞后48、96和120h时材料两断端厚度、极限抗张强度(ultimatetensionstress,UTS)和断裂伸长率(strainoffailure,SOF),绘制应力-应变曲线。取成年杂种犬3只,体重20～30kg,雌雄不限。将脱细胞前后片状主动脉基质埋植于犬脊柱两侧皮下,分别于埋植后1、3和6周取材,行HE染色观察,参照半定量的Wakitani评分法,对取材时的大体形态、浸润细胞种类和数量、新生血管等指标进行比较,观察宿主炎性细胞反应和脱细胞基质变化。将犬内皮细胞种植于猪脱细胞基质,HE染色和扫描电镜观察细胞相容性。结果HE染色和电镜检查显示在96h可将新鲜猪主动脉细胞成分脱除,Masson染色显示细胞外纤维成分保留完整。脱细胞前后的动脉基质厚度、UTS和SOF差异均无统计学意义(P>0.05),但UTS显示降低趋势,SOF则呈现增加趋势,应力-应变曲线呈现力学强度降低和延展性增加的变化趋势。犬皮下埋植,各组脱细胞标本炎性细胞浸润明显减轻,6周时以成纤维细胞浸润为主,且基质中见新生毛细血管。半定量组织学评分,在大体观察、浸润细胞种类和数量方面与脱细胞前比较有统计学意义(P<0.05);新生血管数量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色和扫描电镜显示种植的内皮细胞可在基质表面形成单细胞层。结论应用0.1%胰蛋白酶和0.01%EDTA持续振荡96h制备的猪主动脉脱细胞基质,在生物力学、免疫原性和细胞相容性方面可满足血管组织工程的需要。 展开更多

关键词 组织工程 猪主动脉 脱细胞基质 生物力学 免疫原性

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基因Ⅰ型猪乙型脑炎灭活疫苗免疫原性评价 被引量：4

3

作者 冯瑶 岳辉喜 +6 位作者 刘洪明 曹三杰 伍锐 黄小波 文翼平 赵勤 文心田 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期889-895,共7页

为了评估猪基因Ⅰ型乙型脑炎病毒YA1株、CZ株灭活疫苗的免疫原性,通过将YA1株、CZ株乙脑病毒分别在乳鼠脑内连续传代,获得了高病毒含量的鼠脑病毒液。将佐剂ISA206分别与灭活的YA1株、CZ株乙脑病毒液混合,制备成鼠脑灭活苗。将YA1株、C... 为了评估猪基因Ⅰ型乙型脑炎病毒YA1株、CZ株灭活疫苗的免疫原性,通过将YA1株、CZ株乙脑病毒分别在乳鼠脑内连续传代,获得了高病毒含量的鼠脑病毒液。将佐剂ISA206分别与灭活的YA1株、CZ株乙脑病毒液混合,制备成鼠脑灭活苗。将YA1株、CZ株鼠脑灭活苗以及HW1株商品化鼠脑灭活苗分别免疫接种小鼠、豚鼠、仔猪,采用间接ELISA试验、血凝抑制试验、病毒中和试验以及攻毒保护试验分别检测IgG抗体、血凝抑制抗体、中和抗体的的产生情况以及疫苗对小鼠的攻毒保护率。结果显示YA1株、CZ株灭活苗在小鼠和仔猪上产生的IgG抗体、在豚鼠上产生的血凝抑制抗体、在仔猪上产生的中和抗体以及对小鼠的攻毒保护率均高于HW1株。结果表明乙脑病毒YA1株、CZ株灭活苗的免疫原性优于HW1株,其中CZ株灭活苗的免疫原性最优。 展开更多

关键词 乙型脑炎病毒 基因Ⅰ型 基因Ⅲ型 灭活苗 免疫原性

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鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析 被引量：3

4

作者 付小哲 李宁求 +4 位作者 彭媛媛 林强 石存斌 黄志斌 吴淑勤 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期427-433,共7页

从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组09... 从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。 展开更多

关键词 鳜 传染性脾.肾坏死病毒 ORF093 免疫原性

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稳定表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞株的建立及其免疫原性分析 被引量：2

5

作者 江秀玲 毕富勇 +4 位作者 王华茂 石必枝 张捷 汪茗 李宗海 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期612-615,共4页

目的:建立表皮生长因子突变体Ⅲ胞外区(EGFRvⅡ-Iex)的NIH3T3稳定细胞系并分析其免疫原性。方法:将编码EGFRvⅢex基因的表达质粒pLNCX2-EGFRvⅢex转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,得到多个细胞克隆。采用免疫组化和Western blot法... 目的:建立表皮生长因子突变体Ⅲ胞外区(EGFRvⅡ-Iex)的NIH3T3稳定细胞系并分析其免疫原性。方法:将编码EGFRvⅢex基因的表达质粒pLNCX2-EGFRvⅢex转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,得到多个细胞克隆。采用免疫组化和Western blot法鉴定这些细胞克隆。选取高表达EG-FRvⅢex的细胞株(命名为3T3-vⅢex)免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。用ELISA、Western blot和免疫荧光分别检测抗血清的效价和特异性。结果:成功地构建了真核表达载体pLNCX2-EGFRvⅢex并获得了稳定高表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞系3T3-vⅢex。用3T3-vⅢex免疫小鼠所获得的抗血清效价为10-5。Western blot和免疫荧光鉴定证明抗血清可以与EGFR-vⅢex特异结合。结论:人EGFRvⅢex可在NIH3T3细胞内获得稳定表达,以其免疫小鼠可以获得高效价、高特异性的抗血清。 展开更多

关键词 NIH3T3 表皮生长因子受体突变体Ⅲ 稳定细胞系 免疫原性 抗体

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鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达 被引量：2

6

作者 刘志科 张秋雨 +8 位作者 杨宁宁 徐锦凤 徐明国 荆明龙 吴文星 曹旭东 任艳 石峰 陈创夫 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2018年第8期9-15,共7页

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋... 【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。 展开更多

关键词 鸡白痢沙门氏菌 invA基因 原核表达 生物信息学分析 免疫反应性

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两种方法制备的C群脑膜炎球菌多糖CRM_(197)蛋白结合物生物学特性、热稳定性及免疫原性的对比 被引量：1

7

作者 孙述学 张景春 +5 位作者 马宏初 刘晓磊 褚自青 穆姗姗 刘峰 周荔葆 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第11期1173-1176,1181,共5页

目的分析两种方法制备C群脑膜炎球菌多糖CRM_(197)蛋白结合物的主要生物学特性,并对比其热稳定性和免疫原性,选择适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法。方法采用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化C群多糖,经己二酸二酰... 目的分析两种方法制备C群脑膜炎球菌多糖CRM_(197)蛋白结合物的主要生物学特性,并对比其热稳定性和免疫原性,选择适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法。方法采用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化C群多糖,经己二酸二酰肼(ADH)衍生后,在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDAC)的催化作用下与CRM_(197)共价结合,获得结合物CPS_(_CDAP)AH-CRM_(197);将C群多糖不经活化直接通过ADH衍生后,在EDAC的催化下与CRM_(197)共价结合,获得结合物CPS_(_EDAC)AH-CRM_(197)。对两种方法制备结合物的多糖含量、游离多糖含量、蛋白含量及多糖衍生度等生化指标进行测定,并计算多糖利用率;将结合物分别于37℃放置2周、3周,20～25℃放置4周和8周后取样,测定游离多糖含量;将两种方法制备的结合物免疫小鼠后,检测小鼠血清中C群多糖IgG抗体水平;体外杀菌试验评价结合物的功能性杀菌抗体水平。结果结合物CPS_(_CDAP)AH-CRM_(197)的多糖衍生度较低,游离多糖含量较高,平均多糖利用率为12.2%,于37及22～25℃温度下保存稳定性较差;结合物CPS_(_EDAC)AH-CRM_(197)的多糖利用率比前者高近2倍,游离多糖含量较低,在37和22～25℃温度下保存均表现出良好的热稳定性(游离多糖含量均未超过5%)。CPS_(_EDAC)AH-CRM_(197)组小鼠血清IgG抗体水平显著高于CPS_(_CDAP)AH-CRM_(197)组(P<0.05),但两者诱导的杀菌抗体水平相当(P>0.05)。结论C群多糖不经活化直接与蛋白结合的方法更适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备。 展开更多

关键词 C群脑膜炎球菌多糖 CRM_(197)蛋白 结合疫苗 热稳定性 免疫原性

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乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性 被引量：1

8

作者 吕文利 王凌 +2 位作者 赵新华 俞娟 明平刚 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第10期1258-1260,共3页

目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒... 目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度,细胞病变法检测风疹病毒滴度;通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内;联合疫苗于37℃放置7 d,与放置前相比,风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1.0 LgCCID50/ml和1.0 LgPFU/ml,符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应;鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后,乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性,本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。 展开更多

关键词 风疹减毒活疫苗 乙型脑炎减毒活疫苗 联合疫苗 免疫原性 相容性

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EB病毒gp85 N端片段的原核表达与初步鉴定

9

作者 涂向东 吴玉水 +4 位作者 邱龙翔 连云宗 程烽 兰风华 朱忠勇 《福州总医院学报》 2008年第1期22-24,共3页

目的:构建EB病毒的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达;分析非糖基化的EB病毒包膜糖蛋白gp85N端截短片段的抗原性。方法:采用基因工程技术,以EB病毒B95-8细胞培养上清为模板,PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片断。PCR产物经HindⅢ和Xho... 目的:构建EB病毒的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达;分析非糖基化的EB病毒包膜糖蛋白gp85N端截短片段的抗原性。方法:采用基因工程技术,以EB病毒B95-8细胞培养上清为模板,PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片断。PCR产物经HindⅢ和XhoⅠ双酶切,并插入原核表达载体pGEX-5T,构建pGEX5T-85N重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达gp85N蛋白。纯化表达的蛋白进行蛋白免疫印迹鉴定,并免疫BALB/C小鼠。结果:序列分析表明,插入片段的序列与GenBank登录的参考序列完全一致。重组表达的蛋白的分子量约为45kD,与预期大小相符。可溶性重组蛋白纯化后免疫BALB/C小鼠,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体,且gp85单抗可识别所表达的gp85N抗原。Western blot结果显示,该抗原可与小鼠免疫血清起特异反应。结论:表达并纯化的EB病毒的截短gp85N重组蛋白具有良好的抗原性,为下一步分析所产生抗体的生物学特性提供条件。 展开更多

关键词 Epstein—Barr病毒 gp85 表达 免疫原性

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甲型副伤寒沙门菌spaO—ompA融合基因构建及其表达产物免疫保护作用

10

作者 蒋锦琴 孙一帆 +2 位作者 岳文燕 严杰 阮萍 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期152-156,共5页

目的构建甲型副伤寒沙门菌spaO—ompA融合基因及其原核表达系统，确定重组表达产物rSpaO—OmpA免疫保护作用。方法采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因，构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE和Bio—Rad凝胶图像分析... 目的构建甲型副伤寒沙门菌spaO—ompA融合基因及其原核表达系统，确定重组表达产物rSpaO—OmpA免疫保护作用。方法采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因，构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE和Bio—Rad凝胶图像分析系统检测目的重组表达产物rSpaO—OmpA表达情况及其产量。采用免疫扩散法、微量肥达和Westernblot法鉴定rSpaO—OmpA抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rSpaO—OmpA对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用，实验中采用重组表达的SpaO（rSpaO）及OmpA（rOmpA）作为对照。结果所构建的spaO-ompA融合基因与spaO或ompA单基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统EcoliBk21DE3pET42a-spaO-ompA能高效表达重组融合蛋白rSpaO-OmpA。rSpaO-OmpA能与甲型副伤寒沙门菌全菌抗血清结合并产生阳性杂交信号，免疫家兔后可产生特异性抗体。100汕g或2006xgrSpaO—OmpA对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率分别为66．7％（8／12）和83．3％（10／12），明显高于等量rSpaO及rOmpA（P〈0．05）。rSpaO—OmpA免疫小鼠血清与不同副伤寒沙门菌H抗原的凝集效价为1：5～1：40、与rSpaO和rOmpA及rSpaO—OmpA免疫双扩散效价为1：1～1：16。结论人工融合重组抗原rSpaO—OmpA免疫原性和免疫保护作用较等量rSpaO或rOmpA更强。 展开更多

关键词 甲型副伤寒沙门菌 spaO—ompA融合基因 重组表达 免疫原性 免疫保护性

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乙型肝炎前S疫苗在大学生中二年的免疫原性和安全性评价

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作者 井立臣 李淑秋 +7 位作者 石桂荣 张群弟 张宛 徐淑琴 胡宗汉 宋珍珠 钮家湘 赖建平 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 1995年第3期266-269,共4页

将大学生２４４名血清感染指标均阴性者随机分为３组，分别接种三步灭活和加热灭活疫苗，并设对照组，进行二年的免疫效果的对比观察。结果两疫笛水平一致。首免后７个月（全程免疫后），前者抗－ＨＢｓ阳转率为８９；７％，几何平均滴... 将大学生２４４名血清感染指标均阴性者随机分为３组，分别接种三步灭活和加热灭活疫苗，并设对照组，进行二年的免疫效果的对比观察。结果两疫笛水平一致。首免后７个月（全程免疫后），前者抗－ＨＢｓ阳转率为８９；７％，几何平均滴度５４９．６９ｍＩＵ／ｍｌ。后者不同批号抗－ＨＢｓ阳转率各为１００％和９３．３％，１４μｇ组显著高于前者同剂量组外，１、２年均无差异。几何平均滴度各为５６６．０５和６０１．０７ｍＩＵ／ｍｌ。１、２年结果两疫苗也无显著差异。免后７个月的保护率前者为９１．５％，后者为８８．６％，也无显著差异。两种疫苗的反应均较轻微。 展开更多

关键词 乙型肝炎疫苗 疫苗 免疫原性 安全性

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