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产中性纤维素酶特异腐质霉H31-3复合诱变研究 被引量:8
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作者 芦敬华 石家骥 +2 位作者 葛克山 崔福绵 钱世钧 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期74-78,共5页
中性纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药行业均具有广泛的应用。采用离子束注入技术对中性纤维素酶产生菌特异腐质霉(Humicolainsolens)H31-3进行诱变,经发酵筛选获得较高酶活力且传代稳定的正突变菌株H14,制备其原生质体后进行紫外诱变... 中性纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药行业均具有广泛的应用。采用离子束注入技术对中性纤维素酶产生菌特异腐质霉(Humicolainsolens)H31-3进行诱变,经发酵筛选获得较高酶活力且传代稳定的正突变菌株H14,制备其原生质体后进行紫外诱变。筛选后得到正突变菌株H14-2,最终CMC酶、滤纸酶活力分别达82.56IU/mL和5.77IU/mL,较原始菌株提高了78.57%和106.81%。 展开更多
关键词 中性纤维素酶 特异腐质霉 离子注入 紫外诱变
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特异腐质霉中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆及表达 被引量:7
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作者 谭慧芳 张国青 +2 位作者 郑光宇 崔福绵 钱世钧 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期68-73,共6页
利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicolainsolens)H31-3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因egl2的cDNA,将其插入到表达载体pGAPZαA中,重组质粒经线性化,电击转化毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株GS115,筛选到分泌表达重组EGⅡ的... 利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicolainsolens)H31-3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因egl2的cDNA,将其插入到表达载体pGAPZαA中,重组质粒经线性化,电击转化毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株GS115,筛选到分泌表达重组EGⅡ的毕赤酵母工程菌株。SDS-PAGE检测结果表明,重组EGⅡ在酵母中得到了特异性表达,表达产物的表观分子量约为55kD,同时对工程菌株的发酵条件和重组EGⅡ的性质进行了初步研究。 展开更多
关键词 特异腐质霉 毕赤酵母 内切葡聚糖酶Ⅱ 分泌表达
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特异腐质霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质 被引量:7
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作者 郑海英 黄平 +3 位作者 蔡少丽 柯崇榕 林国滟 黄建忠 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期145-153,共9页
【目的】在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究。【方法】利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ)的cDNA。将其插入表... 【目的】在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究。【方法】利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ)的cDNA。将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115。【结果】SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达。重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70°C,且在65°C以下具有较好的热稳定性。最适反应pH为6.5,在pH 6.0?7.0之间有较好的稳定性。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础。 展开更多
关键词 中性内切葡聚糖酶Ⅱ 特异腐质霉 毕赤酵母
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重组Humicola insolens角质酶的高密度发酵优化 被引量:2
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作者 黄燕 孙益荣 +1 位作者 吴敬 宿玲恰 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期63-70,共8页
在采用前期已构建的重组菌E. coli BL21(DE3)/pET20b(+)-hic进行高密度发酵制备角质酶时发现,在高诱导强度发酵时,菌体浓度下降明显。同时,通过测定纯化重组角质酶的磷脂水解活性,考察验证了重组酶对宿主细胞的损伤作用。重组酶的磷脂... 在采用前期已构建的重组菌E. coli BL21(DE3)/pET20b(+)-hic进行高密度发酵制备角质酶时发现,在高诱导强度发酵时,菌体浓度下降明显。同时,通过测定纯化重组角质酶的磷脂水解活性,考察验证了重组酶对宿主细胞的损伤作用。重组酶的磷脂酰乙醇胺活性为9. 8U/mg(NPB水解比活力为1 047. 6 U/mg),在卵黄平板出现了明显的反应圈现象。在此基础上尝试了高菌体浓度结合高诱导强度的发酵策略,以进一步提高重组酶在3L罐中的表达水平。优化后的最佳条件及结果为:OD_(600)为75时,恒速流加0. 8g/(L·h)的乳糖溶液,发酵24h后,酶活达到最大值4 788. 0U/ml,约为摇瓶发酵酶活的28倍,与OD_(600)为50时、流加0. 2 g/(L·h)进行诱导的发酵策略(酶活2 233. 0 U/ml)相比,提高幅度约为114. 0%,发酵时间缩短40. 0%。 展开更多
关键词 humicola insolens 角质酶 磷脂酶活性 高密度发酵
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中性纤维素酶外切葡聚糖酶CBHⅡ的异源表达 被引量:2
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作者 林国滟 蔡少丽 +6 位作者 黄平 郑海英 柯崇榕 杨章萍 蔡水淋 林艺平 黄建忠 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2011年第6期88-91,共4页
利用聚合酶链式反应(PCR)技术,从本实验室保存的1株特异腐质霉EIM-50上克隆到中性纤维素酶外切葡聚糖酶基因(CBHⅡ)全长序列,大小约为1 586 bp。将其克隆到pPIC9K上,成功构建重组质粒pPIC9K-CBHⅡ,并经电转化引入毕赤酵母(Pichia pastor... 利用聚合酶链式反应(PCR)技术,从本实验室保存的1株特异腐质霉EIM-50上克隆到中性纤维素酶外切葡聚糖酶基因(CBHⅡ)全长序列,大小约为1 586 bp。将其克隆到pPIC9K上,成功构建重组质粒pPIC9K-CBHⅡ,并经电转化引入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,进行异源表达。SDS-PAGE银染结果表明,该重组质粒在毕赤酵母中获得了异源表达。gel pro Analyser软件分析其表达蛋白的表观分子量约为62.548ku。用BandScan软件分析其蛋白表达量为2.3%,即0.738μg/mL(mg/L)。 展开更多
关键词 特异腐质霉 中性外切葡聚糖酶 毕赤酵母 异源表达
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一株特异腐质霉纤维素酶高产突变株的鉴定分析 被引量:1
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作者 陈媛 李金阳 +4 位作者 张宇宏 刘波 张志伟 徐欣欣 张伟 《生物技术进展》 2019年第2期185-190,共6页
高温真菌特异腐质霉(Humicola insolens)具有强大的纤维素酶分泌和纤维素降解能力,因此在生物质能源、饲料和纺织工业等领域中具有良好的应用前景。在特异腐质霉T-DNA随机插入突变体库中筛选得到一株纤维素酶高产菌株T53。在纤维素诱导... 高温真菌特异腐质霉(Humicola insolens)具有强大的纤维素酶分泌和纤维素降解能力,因此在生物质能源、饲料和纺织工业等领域中具有良好的应用前景。在特异腐质霉T-DNA随机插入突变体库中筛选得到一株纤维素酶高产菌株T53。在纤维素诱导培养条件下,突变株T53发酵上清中的滤纸酶活力、内切β-1,4葡聚糖酶活力、纤维二糖水解酶活力、β-葡萄糖苷酶活力以及木聚糖酶活力较野生型菌株分别提高了40%、60%、90%、10%、60%。蛋白电泳结果显示,T53菌株的胞外总蛋白特别是纤维素酶与半纤维素酶的分泌量较野生型菌株有显著提高。TAIL-PCR克隆鉴定了T53菌株中的T-DNA插入位点侧翼序列,结果表明T-DNA插入位点位于一个可能的C2H2型锌指蛋白类转录因子编码基因的上游启动子区域。这为揭示突变株T53中纤维素酶的高产分子机制奠定了重要基础,有助于理解特异腐质霉中纤维素酶的表达调控机制,为特异腐质霉纤维素酶高产工程菌的构建奠定了理论和技术基础。 展开更多
关键词 特异腐质霉 纤维素酶 T-DNA随机插入 锌指蛋白
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特异腐质霉葡糖化酶催化生淀粉一步糖化的酶学特征 被引量:1
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作者 杨忠义 杨敬 +1 位作者 崔福绵 钞亚鹏 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期213-219,共7页
从北京西郊森林土壤中分离到产生糖化生淀粉的葡糖化酶的特异腐质霉Humicola insolens HG‐618菌株。优化的产酶培养基如下:6%麦麸、2%玉米粉、0.7%磷酸氢二铵和1%玉米浆,p H 8.0,250m L三角瓶装40m L培养基,在40℃和280r/min培养90h。... 从北京西郊森林土壤中分离到产生糖化生淀粉的葡糖化酶的特异腐质霉Humicola insolens HG‐618菌株。优化的产酶培养基如下:6%麦麸、2%玉米粉、0.7%磷酸氢二铵和1%玉米浆,p H 8.0,250m L三角瓶装40m L培养基,在40℃和280r/min培养90h。以生玉米淀粉为底物,发酵液中葡糖化酶活力为180U/m L。酶学性质试验表明,该酶的最适反应p H为6.0,最适反应温度为65℃;在p H 6.0–9.0范围酶活力稳定;酶热稳定性强,在60℃和p H 6.0保温8h,酶活力仍保留83%。一步糖化生玉米粉试验表明,在50m L 30%浓度生玉米粉浆和270U HG‐618葡糖化酶的反应体系中,采用自然p H 6.7,在55℃和100r/min条件下糖化40h。获得的糖化液还原糖浓度为17.1%(由酶产生的还原糖浓度为15.9%),生玉米粉中所含淀粉的糖化率为90%,且产生的糖全部为葡萄糖。因此,该葡糖化酶具有良好的一步糖化生玉米粉前景,它也可以用于生大米粉、生小麦粉和生马铃薯粉的直接糖化。 展开更多
关键词 生淀粉糖化 直接糖化 一步糖化 葡糖化酶 特异腐质霉 生玉米粉
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特异腐质霉纤维素酶的分离纯化与性质
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作者 王在贵 何瑞国 +2 位作者 张宏福 钱世钧 刘朝良 《激光生物学报》 CAS CSCD 2008年第4期549-553,共5页
特异腐质霉Humicola insolens(YH-8)能高效合成高稳定性的纤维素酶。由该菌株所产的纤维素酶粗液经过1.5倍酒精沉淀、DEAE-SephadexA-50离子交换层析,SephadexG-100凝胶过滤,得到电泳纯的纤维素酶组分一个。对这个组分的催化性质... 特异腐质霉Humicola insolens(YH-8)能高效合成高稳定性的纤维素酶。由该菌株所产的纤维素酶粗液经过1.5倍酒精沉淀、DEAE-SephadexA-50离子交换层析,SephadexG-100凝胶过滤,得到电泳纯的纤维素酶组分一个。对这个组分的催化性质(以羧甲基纤维素为底物)进行了研究,该酶的最适催化温度60℃,pH值为5.5,在50℃以下酶的稳定性较好,70℃条件下底物对酶有较强的保护作用,该酶的pH稳定性范围为4~8,Zn^2+,Ca^2+,Mg^2+,K^+,Li^+对酶活有促进作用,Mn^2+、Co^2+、Fe^2+、Fe^3+对酶活起抑制作用,酶对CMC-Na和水杨素有分解作用,而不分解脱脂棉和滤纸。 展开更多
关键词 特异腐质霉 纤维素酶 纯化 催化性质
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特异腐质霉角质酶在大肠杆菌中的表达和发酵优化 被引量:1
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作者 孙益荣 吴敬 宿玲恰 《食品与机械》 CSCD 北大核心 2018年第4期1-5,共5页
应用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)表达系统实现特异腐质霉(Humicola insolens,H.insolens)来源角质酶的重组表达。对重组角质酶进行酶学性质研究,发现其最适pH为8.5、最适温度为80℃,并有良好的pH稳定性和温度稳定性。... 应用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)表达系统实现特异腐质霉(Humicola insolens,H.insolens)来源角质酶的重组表达。对重组角质酶进行酶学性质研究,发现其最适pH为8.5、最适温度为80℃,并有良好的pH稳定性和温度稳定性。经3L发酵罐中扩大培养并进行发酵条件优化,其最佳发酵条件:发酵前期控制菌体生长pH 7.0、温度37℃,培养时间12~14h;菌体浓度OD600达到50时进入诱导期,调节温度降至30℃,恒速流加0.2g/(L·h)的乳糖溶液进行诱导,总发酵周期为36h,最高酶活2 233U/mL,是摇瓶水平酶活的13倍。 展开更多
关键词 特异腐质霉 角质酶 重组大肠杆菌 发酵优化
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特异腐质酶Humicola insolens Y1耐热型木聚糖酶基因的克隆及酶学性质分析
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作者 李雅楠 余利红 +2 位作者 李昀楷 马文康 张伟 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期121-128,共8页
利用简并PCR和TAIL-PCR从嗜热特异腐质霉Humicola insolens Y1中克隆得到一个新的耐热型木聚糖酶基因xynD。该基因全长1 104 bp,共编码367个氨基酸,不含有内含子,N端的22个氨基酸为信号肽。成熟蛋白在毕赤酵母中进行了重组表达,重组蛋... 利用简并PCR和TAIL-PCR从嗜热特异腐质霉Humicola insolens Y1中克隆得到一个新的耐热型木聚糖酶基因xynD。该基因全长1 104 bp,共编码367个氨基酸,不含有内含子,N端的22个氨基酸为信号肽。成熟蛋白在毕赤酵母中进行了重组表达,重组蛋白经超滤和离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明,XynD的最适pH为6.0,在pH 4.0~7.0可以保持80%以上的酶活性,在pH 5.0~10.0具有良好的pH稳定性。最适作用温度为70℃,在60℃条件下保持稳定。多数金属离子对XynD酶活力没有明显的影响。麦芽汁降解实验表明,XynD与商用β-葡聚糖共同作用可以提高麦芽的过滤速率(45.7%)并降低粘度(8.1%)。因此XynD在酿酒业,特别是啤酒制造业具有潜在的应用价值。 展开更多
关键词 humicola insolens Y1 木聚糖酶 基因克隆与表达 酶学性质
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特异腐质霉Humicola insolens(YH-8)纤维素酶的催化性质研究 被引量:2
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作者 王在贵 范涛 《中国农学通报》 CSCD 2006年第3期115-118,共4页
对诱变后的特异腐质霉Humicolainsolens(YH-8)纤维素酶的催化性质进行了研究。结果表明:该酶的最适催化温度和pH值分别为65℃和6.0,在50℃以下酶的稳定性较好,70℃条件下底物对酶有较强的保护作用,该酶的pH稳定性范围为6.0 ̄9.0,Zn2+、K... 对诱变后的特异腐质霉Humicolainsolens(YH-8)纤维素酶的催化性质进行了研究。结果表明:该酶的最适催化温度和pH值分别为65℃和6.0,在50℃以下酶的稳定性较好,70℃条件下底物对酶有较强的保护作用,该酶的pH稳定性范围为6.0 ̄9.0,Zn2+、K+、Li+对酶活有促进作用,Mn2+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Fe2+、Fe3+对酶活起抑制作用,其中Fe3+对酶的抑制作用非常强,酶对CMC和水杨素有分解作用,而几乎不分解脱脂棉、微晶纤维素和滤纸。 展开更多
关键词 特异腐质霉 纤维素酶 催化性质 活力
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特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达
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作者 晏婷婷 刘展志 +1 位作者 李光耀 吴敬 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4918-4926,共9页
【目的】通过探究特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白(HiC-OMP25)在不同大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中的表达情况、底物降解情况、热稳定性及宿主菌细胞膜通透性与细胞表面疏水性,揭示表达HiC-OMP25时不同宿主菌的差异性,并进一步提高H... 【目的】通过探究特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白(HiC-OMP25)在不同大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中的表达情况、底物降解情况、热稳定性及宿主菌细胞膜通透性与细胞表面疏水性,揭示表达HiC-OMP25时不同宿主菌的差异性,并进一步提高HiC-OMP25在大肠杆菌中的表达量。【方法】分别在E.coli BL21(DE3)及E.coli C43(DE3)中表达HiC-OMP25,并测定其对对硝基苯丁酸酯(4-nitrophenol butyrate,p NPB)、聚丙烯酸乙酯(polyethyl acrylate,PEA)的降解效果、50℃稳定性;测定表达HiC-OMP25时宿主菌的细胞膜通透性及细胞表面疏水性变化;共表达伴侣蛋白提高HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中的表达量。【结果】HiC-OMP25在E.coli BL21(DE3)与E.coli C43(DE3)中均成功表达并降解pNPB,但前者对PEA的降解效果及50℃稳定性均低于后者。同时,表达HiC-OMP25显著增强了E.coli BL21(DE3)的细胞膜通透性及细胞表面疏水性。HiC-OMP25与巯基氧化酶(Erv1p)、二硫键异构酶(DsbC)在E.coli C43(DE3)中共表达时,其表达量为原始菌株的2.14倍,且对pNPB及PEA均有良好的降解效果。【结论】异源表达时,HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中正确折叠,而在E.coli BL21(DE3)中未完全正确折叠;通过共表达伴侣蛋白提高了HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中的表达量,为以后HiC-OMP25的工业化生产及应用奠定了基础。 展开更多
关键词 HiC-OMP25 Escherichia coli BL21(DE3) Escherichia coli C43(DE3) 细胞膜通透性 细胞表面疏水性 伴侣蛋白
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