目的建立稳定过表达N-cadherin的人类胃癌MGC-803细胞系。方法从含有N-cadherin的质粒中利用PCR技术克隆N-cadherin基因编码序列。制备并浓缩慢病毒颗粒,将构建好的过表达N-cadherin慢病毒载体感染MGC-803细胞,并稳定遗传,嘌呤霉素筛选...目的建立稳定过表达N-cadherin的人类胃癌MGC-803细胞系。方法从含有N-cadherin的质粒中利用PCR技术克隆N-cadherin基因编码序列。制备并浓缩慢病毒颗粒,将构建好的过表达N-cadherin慢病毒载体感染MGC-803细胞,并稳定遗传,嘌呤霉素筛选的阳性克隆传代培养5代后鉴定细胞内N-cadherin的表达。结果荧光显微镜下过表达N-cadherin组细胞有绿色荧光表达;PCR扩增得到含N-cadherin基因编码序列的特异性条带;重组的过表达N-cadherin载体中,过表达N-cadherin编码序列与目标序列几乎一致;Western blotting结果显示,在分子量为98 k D处有相应条带。结论成功建立稳定过表达N-cadherin的人类胃癌MGC-803细胞,此研究为进一步探讨N-cadherin基因的功能提供了良好的研究基础。展开更多
文摘该文探讨了RORα(retinoid acid receptor related orphan receptorα)高表达对人胃癌MGC803细胞Wnt/β-catenin信号通路靶基因的作用。采用MTT检测了MGC803细胞增殖。采用RT-PCR、Western blot与免疫共沉淀检测了Wnt/β-catenin信号通路相关分子与靶基因表达。荧光素酶报告基因方法检测c-Myc基因启动子活性。MTT结果显示,RORα高表达人胃癌MGC803细胞的增殖能力较对照组明显减弱(P<0.05)。RT-PCR与Western blot结果显示,RORα高表达组Wnt1m RNA与蛋白质水平较对照组下调(P<0.05),而β-catenin m RNA与蛋白质水平无差异(P>0.05)。免疫共沉淀结果显示,RORα高表达组RORα与β-catenin结合明显增加(P<0.05)。RORα高表达可显著下调核内β-catenin水平(P<0.05),同时可显著下调TCF-4(T cell factor-4)蛋白质水平(P<0.05)。RORα高表达可显著下调Axin、c-Myc、c-Jun m RNA与蛋白质水平(P<0.05)。荧光素酶报告基因实验结果显示,RORα高表达c-Myc启动子活性明显降低(P<0.05)。以上结果表明,RORα高表达可通过调控Wnt/β-catenin信号通路相关分子基因表达来抑制人胃癌细胞增殖。
文摘目的建立稳定过表达N-cadherin的人类胃癌MGC-803细胞系。方法从含有N-cadherin的质粒中利用PCR技术克隆N-cadherin基因编码序列。制备并浓缩慢病毒颗粒,将构建好的过表达N-cadherin慢病毒载体感染MGC-803细胞,并稳定遗传,嘌呤霉素筛选的阳性克隆传代培养5代后鉴定细胞内N-cadherin的表达。结果荧光显微镜下过表达N-cadherin组细胞有绿色荧光表达;PCR扩增得到含N-cadherin基因编码序列的特异性条带;重组的过表达N-cadherin载体中,过表达N-cadherin编码序列与目标序列几乎一致;Western blotting结果显示,在分子量为98 k D处有相应条带。结论成功建立稳定过表达N-cadherin的人类胃癌MGC-803细胞,此研究为进一步探讨N-cadherin基因的功能提供了良好的研究基础。