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人胚胎干细胞建株与维持培养条件的优化 被引量：4
1
作者 蒋伟民 黄元华 马燕琳 《生命科学研究》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期349-352,366,共5页
人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞,它具有无限增殖、自我更新和全能分化的特性。无论在体内还是体外环境,人胚胎干细胞都能分化为机体几乎所有类型的细胞。基于其全能分化性,胚... 人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞,它具有无限增殖、自我更新和全能分化的特性。无论在体内还是体外环境,人胚胎干细胞都能分化为机体几乎所有类型的细胞。基于其全能分化性,胚胎干细胞成为治疗各种退行性疾病的理想细胞来源。然而,在目前培养条件下所建立的胚胎干细胞株,仍然存在动物源性物质潜在污染的问题。因此,更优化的建株及培养条件十分重要。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞(hesc) 内细胞团 饲养层细胞 培养条件 mTESR1
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人胚胎干细胞膜的特异多肽受体研究
2
作者 谭之扬 金磊 +1 位作者 赵文秀 马岚 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第31期6001-6005,共5页
目的:通过多肽筛选和比较分析,找到针对人胚胎干细胞(hESC)特异结合的多肽的膜受体蛋白,为相关通路或特异膜表面蛋白下游的研究奠定基础。方法:首先,在前期运用噬菌体展示技术的基础上进行ELISA重筛选,通过对比结合强度的大小,挑选出特... 目的:通过多肽筛选和比较分析,找到针对人胚胎干细胞(hESC)特异结合的多肽的膜受体蛋白,为相关通路或特异膜表面蛋白下游的研究奠定基础。方法:首先,在前期运用噬菌体展示技术的基础上进行ELISA重筛选,通过对比结合强度的大小,挑选出特异性结合人胚胎干细胞的噬菌体多肽并且进行测序和合成有poly-his标签的多肽;然后运用His Pull-Down系统获得特异结合人胚胎干细胞的某一特殊噬菌体12肽的膜上靶分子受体蛋白;最后质谱测序后通过Mascot数据库和NCBI进行序列信息分析。结果:1通过ELISA重筛选,得到了高特异性结合人胚胎干细胞的两个噬菌体序列,其序列分别为HGAAWGTRTGHV(HGA)和VPATETAQAGHA(VPA)。2通过His Pull-Down实验得到了一个针对多肽VPA的特异性膜蛋白受体。3通过MALD质谱分析以及NCBI的数据库搜索分析,进一步确认这一VPA多肽特异性结合的潜在受体蛋白可能属于HECT超级家族。结论:寻找到一个潜在未知的人胚胎干细胞的特异表面标志物,此膜受体可与VPA多肽特异性结合,为人胚胎干细胞的筛选和鉴定提供了重要指标。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞(hesc) VPATETAQAGHA 多肽 HIS Pull-Down
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体外诱导人胚胎干细胞向滋养层细胞分化的研究进展
3
作者 涂晓宇 孙莹璞 《生殖与避孕》 CAS CSCD 2013年第11期760-764,共5页
目前在体外研究中,主要通过分离胚体和骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)诱导这2种途径从人胚胎干细胞(hESC)分化获取滋养层细胞(TB)。胚体途径可基于细胞的黏附性和培养基中β-hCG的含量从胚体中分离获得TB,进而在... 目前在体外研究中,主要通过分离胚体和骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)诱导这2种途径从人胚胎干细胞(hESC)分化获取滋养层细胞(TB)。胚体途径可基于细胞的黏附性和培养基中β-hCG的含量从胚体中分离获得TB,进而在三维培养体系中可检测细胞的侵袭性及细胞与基质的相互作用。BMP4途径通过去除外源性成纤维细胞生长因子及提高氧含量均可促进BMP4诱导TB的分化。虽然hESC分化TB模型目前还存在一些争议,但是相关研究可为探讨人类胚胎的植入及胎盘的形成提供重要的理论依据。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞(hesc) 滋养层细胞(TB) 胚体 骨形态发生蛋白4(BMP4) 分化
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SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞分化过程中的不同调控作用
4
作者 赵冰楠 马双羽 +1 位作者 胥春龙 王琼 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期443-454,共12页
目的·探究转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)家族下游的关键转录因子SMAD蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)——SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)体外分化... 目的·探究转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)家族下游的关键转录因子SMAD蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)——SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)体外分化过程中的不同作用。方法·在hESC中,通过蛋白质印迹法(Western blotting)检测SMAD2和SMAD3在分化过程中的蛋白表达水平。通过CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技术构建SMAD2敲除(SMAD2 knockout,SMAD2KO)和SMAD3敲除(SMAD3 knockout,SMAD3KO)的细胞系。利用免疫荧光染色检测SMAD蛋白丢失对多能性因子八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,SOX2),神经外胚层(neuroectoderm,NE)标志因子配对盒因子6(paired box 6,PAX6)和性别决定区Y框蛋白1(sex determining region Y-box 1,SOX1)以及中内胚层(mesendoderm,ME)标志因子SOX17的表达影响;同时使用流式细胞术鉴定SMAD2敲除或SMAD3敲除对NE标志因子PAX6以及ME标志因子SOX17、脱中胚蛋白(eomesodermin,EOMES)和C-X-C模体趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)表达的影响。在SMAD2KO和SMAD3KO细胞中分别过表达SMAD2和SMAD3质粒,通过Western blotting检测SMAD2和SMAD3蛋白回补的效果,并利用实时定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测SMAD蛋白回补后对分化过程中的ME关键因子EOMES、叉头框转录因子A2(forkhead box A2,FOXA2)和GSC同源盒(goosecoid homeobox,GSC)表达的影响。结果·虽然SMAD2和SMAD3的蛋白序列较为相似,但是SMAD2才是hESC中主要表达的蛋白因子。免疫荧光染色结果表明,SMAD2敲除和SMAD3敲除并不会影响hESC多能性因子OCT4和SOX2的表达;同时流式细胞术发现,SMAD蛋白的缺失也不会影响NE标志因子PAX6和SOX1的表达。SMAD3敲除对hESC向ME分化没有显著的影响,而SMAD2敲除严重阻碍了hESC表达ME标� 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 中内胚层分化 SMAD2 SMAD3
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酶消化细胞团块法对人胚胎干细胞中OCT4与SOX2蛋白水平的影响
5
作者 孙潇智 李爽 +1 位作者 金颖 廖兵 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期413-420,共8页
目的·探究酶消化细胞团块法对人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)的八聚体结合转录因子4(octamerbinding protein 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,SOX2)蛋白水平的影响及可能的作用机制... 目的·探究酶消化细胞团块法对人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)的八聚体结合转录因子4(octamerbinding protein 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,SOX2)蛋白水平的影响及可能的作用机制。方法·(1)利用Western blotting分析检测酶消化细胞团块法[分散酶Dispase或胶原酶Ⅳ(collagenase typeⅣ,COL4)]、酶消化单细胞法(细胞分离溶液Accutase或胰酶)和机械刮取法对hESC中OCT4和SOX2蛋白水平的影响。(2)使用金属离子螯合剂乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)破坏hESC-hESC细胞间连接,然后利用Western blotting检测EGTA单独处理或联合COL4处理对hESC中OCT4与SOX2的蛋白水平的影响。(3)通过基于质谱的定量蛋白质组学技术,检测COL4单独处理或与EGTA联合处理hESC细胞样本中差异表达的磷酸化蛋白和总蛋白,并进行功能富集分析。(4)利用Western blotting和免疫荧光染色检测蛋白酶体抑制剂bortezomib或溶酶体抑制剂氯喹预处理对COL4引起的hESC中OCT4与SOX2蛋白水平下调的影响。(5)利用Western blotting检测COL4对丝切蛋白(cofilin)的影响,以及Rac1小分子抑制剂EHT1864和EHop-016对SOX2蛋白表达水平的影响。结果·(1)COL4和Dispase引起OCT4和SOX2的蛋白水平下降;Accutase、胰酶和机械刮取法未观察到此作用。(2)EGTA处理能够抑制COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降。(3)蛋白质谱和功能富集分析发现,COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降可能与肌动蛋白微丝(actin filament,F-actin)、微管和溶酶体相关蛋白的变化有关。(4)氯喹能够抑制COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降,bortezomib则不能。(5)COL4处理或Rac1抑制剂均能下调cofilin和SOX2的蛋白水平。结论·当使用酶消化细胞团块法处理hESC时,OCT4和SOX2蛋白水平下降,Rac1/cofilin/F-actin信号通路和溶酶体可能参与其中。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 细胞外基质 八聚体结合转录因子4 性别决定区Y框蛋白2 溶酶体 丝切蛋白
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利用Crispr/Cas9基因编辑系统在人胚胎干细胞中探索ELABELA的潜在新受体
6
作者 周月 程晨 +5 位作者 郑恩霖 孟卓 王鉴 王青洁 何勇宁 孙锟 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期1258-1264,共7页
目的·利用Crispr/Cas9基因编辑技术在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)中探索小分子多肽ELABELA(ELA)是否存在潜在的新受体。方法·收集干细胞向心肌细胞定向分化过程中不同天数(0~13 d)的细胞,检测其ELA及其受体... 目的·利用Crispr/Cas9基因编辑技术在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)中探索小分子多肽ELABELA(ELA)是否存在潜在的新受体。方法·收集干细胞向心肌细胞定向分化过程中不同天数(0~13 d)的细胞,检测其ELA及其受体APJ的动态表达水平。在干细胞向心肌细胞定向分化过程中加入APJ抑制剂ML221,观察心肌细胞标志物MYH6、TnnT2及NKX2.5的mRNA表达水平是否发生变化。利用人胚肾悬浮细胞(HEK-293F)表达重组ELA绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),研究ELA发挥结合作用的区域在其C末端还是N末端,构建GFP序列分别插入ELA-32序列的C末端及N末端的2种重组质粒。利用Crispr/Cas 9基因编辑技术构建ELA唯一已知受体APJ敲除的hESC并进行验证。在构建成功的敲除细胞系及正常细胞系中外源性加入2种GFP-ELA重组蛋白,通过荧光显微镜观察ELA是否能够进入细胞。结果·在干细胞向心肌细胞定向分化过程中,在干细胞时期,ELA高表达而APJ低表达;ELA表达高峰在分化第6天而APJ表达高峰出现在分化第3天。外源性加入APJ抑制剂ML221后,MYH6、TnnT2及NKX2.5的mRNA表达水平无显著变化(P>0.05)。经过基因DNA测序及Western blotting验证,成功构建敲除APJ干细胞系。敲除APJ后,外源性加入ELA N端荧光蛋白,仍能够进入细胞内;而ELA C端荧光蛋白未出现荧光,表示ELA C端荧光蛋白不能进入细胞。结论·hESC中存在非APJ的ELA其他受体,ELA与受体发生结合的部位主要位于C末端。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 ELABELA APJ 基因编辑
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bFGF诱导MEF生成的条件培养基对人胚胎干细胞生长的影响 被引量：5
7
作者 周轶平 ROCHAT Anne +4 位作者 HATZFELD Antoinette PEIFFER Isabelle BARBET Romain HATZFELD Jacques 李玛琳 《分子细胞生物学报》 CSCD 北大核心 2009年第3期193-199,共7页
为了探讨低浓度bFGF诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)生成的条件培养基对人胚胎干细胞(hESC)生长分化的影响,以系列浓度的bFGF作用于MEF上,收集条件培养基(bFGF-MCM),用于hES2细胞的无滋养层培养。以不添加bFGF而收集的MEF条件培养基(MCM)... 为了探讨低浓度bFGF诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)生成的条件培养基对人胚胎干细胞(hESC)生长分化的影响,以系列浓度的bFGF作用于MEF上,收集条件培养基(bFGF-MCM),用于hES2细胞的无滋养层培养。以不添加bFGF而收集的MEF条件培养基(MCM)为阴性对照,同样浓度的bFGF添加于SR培养基(bFGF-SR)为空白对照。通过形态学特征和碱性磷酸酶染色法对hES2的生长分化状态进行评估。结果发现,培养一周内,未分化hES2克隆的比率,阴性对照为23%;空白对照组为13%-31%。当bFGF浓度为0.1,0.3,1,4ng/ml时,bFGF-MCM组未分化克隆的比率分别为44%,74%,77%和78%,与阴性和空白对照组相比,未分化克隆的比率均有不同程度提高,差异有统计学意义(P<0.01)。该结果揭示了经bFGF诱导的MEF细胞所产生的条件培养基具备了维持hES细胞正常生长而不分化的能力。对bFGF-MCM的深入分析,有望更好地了解hESC的生长与分化机制。 展开更多
关键词 碱性成纤维细胞生长因子 小鼠胚胎成纤维细胞 人胚胎干细胞 条件培养基 分化抑制
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