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TBX3及TBX18在人源诱导多能干细胞向窦房结样细胞富集分化中的作用 被引量：1
1
作者 刘锋 方易冰 +3 位作者 熊琪 罗良琴 周锐 廖斌 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期497-506,共10页
目的探索过表达TBX3、TBX18在人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,HiPS)向窦房结样细胞富集分化的作用。方法取HiPS,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测其干性标记物OCT... 目的探索过表达TBX3、TBX18在人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,HiPS)向窦房结样细胞富集分化的作用。方法取HiPS,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测其干性标记物OCT3/4、SOX2、NANOG表达,并与人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)比较;免疫荧光染色观察HiPS干性标记物OCT3/4、NANOG、SSEA4和TRA-1-60表达。将HiPS向心肌细胞定向分化,qRT-PCR检测心肌前体细胞特异性基因ISL1、NKX2-5(NK2 homeobox 5)以及心肌细胞特异标记物ACTN1、TNNT2表达,以成人心肌细胞(human adult cardiomyocytes,hACM)作为阳性对照;免疫荧光染色观察心肌前体细胞特异核转录因子NKX2-5,心肌细胞特异性收缩蛋白肌球蛋白(cardiac troponin,cTnT)、α-辅肌动蛋白(α-actinin),以及心房肌球蛋白轻链(myosin light chain 2A,MLC-2A)和心室肌球蛋白轻链(myosin light chain 2V,MLC-2V)表达;流式细胞术检测α-actinin阳性率。在HiPS向心肌细胞定向分化第3天(中胚层阶段),以慢病毒方式过表达窦房结相关基因TBX3、TBX18,继续培养至21 d,采用qRT-PCR检测窦房结细胞特异性标记物TBX3、TBX18、SHOX2、NKX2-5、HCN4、HCN1相对表达量,以增强绿色荧光蛋白空白病毒为对照。结果 OCT3/4、SOX2、NANOG在HiPS和ESCs中均高表达,各基因相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);OCT3/4和NANOG在HiPS中特异分布于细胞核中,SSEA4和TRA-1-60分布于细胞膜上。HiPS向心肌细胞分化5、7、21、28 d时ISL1基因以及分化7、21、28 d时NKX2-5基因相对表达量均显著高于hACM(P<0.05),分化3、5、7、21 d ACTN1和TNNT2基因相对表达量均显著低于hACM(P<0.05)。NKX2-5在绝大部分细胞核中表达;cTnT和α-actinin,MLC-2A和MLC-2V信号定位于细胞质中,并初步呈现出肌小结纹理样结构。流式细胞术检测示HiPS向心肌细胞诱导分化成功。过表达TBX3组中,TBX18、SHOX2、HCN4、HCN1较对照组表达均有上调,� 展开更多
关键词 人诱导多能干细胞 TBX3 TBX18 窦房结样细胞
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