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人脑乙酰胆碱酯酶(hAChE)基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定
1
作者 马兴元 谭建华 +2 位作者 魏东芝 朱平 孙曼霁 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期54-60,共7页
研究了hAChE基因在毕赤酵母中的表达。设计并合成引物Pb1和P2,以18周龄引产胎儿大脑组织mRNA为模板,经AMV逆转录和高保真PCR,扩增出序列正确的hAChE成熟肽完整基因约1.8kb,经鉴定获得正确构建的分泌型酵母表达栽体pHIL-S1(hAChE),BglⅡ... 研究了hAChE基因在毕赤酵母中的表达。设计并合成引物Pb1和P2,以18周龄引产胎儿大脑组织mRNA为模板,经AMV逆转录和高保真PCR,扩增出序列正确的hAChE成熟肽完整基因约1.8kb,经鉴定获得正确构建的分泌型酵母表达栽体pHIL-S1(hAChE),BglⅡ线性化后回收的酵母表达单位经电穿孔法转化入毕赤酵母GS115中,经MD/MM营养表型筛选、提取酵母基因组进行PCR鉴定和含3-酰基吲哚培养基进行表达产物的显色反应,初步筛选出分泌表达有hAChE活性的P.patstoris菌22株。依据hAChE酶活性与3-酰基吲哚显色深浅成正比,在平皿和微量反应板上快捷地筛选出高效表达菌pHIL-S1(AChE)(Ⅰ)-7株,SDS-PAGE分析和Western印迹试验表明,产物分子量约为65kDa,经甲醇诱导摇瓶培养,发酵上清原液rhAChE相对酶活性高达4.0mU/ml,表达量占分泌蛋白总量的23.6%。 展开更多
关键词 毕赤酵母 分泌表达 乙酰胆碱酯酶 SDS-PAGE分析 Western印迹 pastoris 人脑 酵母表达载体 ache活性 PCR鉴定 酵母基因组 Hach mRNA 电穿孔法 显色反应 表达产物 高效表达 摇瓶培养 E基因 脑组织 高保真 逆转录 AMV 成熟肽
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