阻断肝再生增强因子的表达对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用 被引量：10

1

作者 唐琳 孙航 +3 位作者 张林 郭晖 张玲 刘杞 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第6期671-676,共6页

背景与目的:前期研究中已发现人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)在肝癌细胞中呈高表达,在正常肝细胞中几乎不表达,并在体外能刺激肝癌细胞株增殖,而对正常肝细胞无影响。本研究通过运用hALR的siRNA和hALR单克... 背景与目的:前期研究中已发现人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)在肝癌细胞中呈高表达,在正常肝细胞中几乎不表达,并在体外能刺激肝癌细胞株增殖,而对正常肝细胞无影响。本研究通过运用hALR的siRNA和hALR单克隆抗体阻断人肝癌细胞株HepG2表达,探讨hALR对细胞增殖的影响。方法:设计、构建siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B。将构建的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以计算转染效率。转染48h后,免疫细胞化学及RT-PCR法检测HepG2细胞中hALR的表达。用3H-TdR掺入法检测hALR的siRNA和特异性单克隆抗体对HepG2细胞增殖的影响。结果:HepG2细胞中有hALR的表达。成功构建了针对hALR基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A。转染入细胞后发现,pSIALR-A能明显抑制hALR的表达(mRNA的表达量减少83%),而随机序列的siRNA却无此作用。hALR的siRNA在体外能显著抑制人肝癌细胞株HepG2增殖,分别转染质粒pSIALR-A和pSIALR-B后HepG2细胞的cpm值为67687±6548和104807±5713(P<0.05)。抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后,可部分抑制肿瘤细胞自主性生长(P<0.05)。结论:HepG2细胞高表达hALR;针对hALR的siRNA能显著、特异性地抑制hALR表达,进而抑制HepG2细胞的生长。抗hALR单克隆抗体也能部分抑制HepG2细胞自主性生长。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 SIRNA 肝肿瘤 单克隆抗体 HEPG2细胞株 细胞增殖

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调节性T细胞在肝再生增强因子免疫抑制机制中的作用研究 被引量：7

2

作者 潘桃 刘杞 +3 位作者 孙航 王娜 石小枫 李小芳 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1194-1198,共5页

目的观察人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)对体外活化的单个核细胞中调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的增殖、分化及抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10表达水平的影响,探讨ALR的免疫抑制机制。方法梯度离心分离... 目的观察人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)对体外活化的单个核细胞中调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的增殖、分化及抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10表达水平的影响,探讨ALR的免疫抑制机制。方法梯度离心分离正常人外周血单个核细胞(human peripheral blood monoclear cells,PBMCs),分为对照组(Control组)、ConA刺激组(ConA组)和人ALR(hALR)干预组(ConA+hALR组)。ConA组和ConA+hALR组分别给予ConA(5μg/mL)和hALR(30μg/mL)处理,对照组不处理。各组作用60 h后,2-对磺酸基苯基-3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-二氢四唑嗡盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt,MTS]检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测各组CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞比例和细胞周期变化,Real-time PCR检测各组FoxP3 mRNA的表达,ELISA检测各组上清中细胞因子TGF-β1、IL-10浓度。结果 hALR能明显抑制ConA活化的PBMCs的增殖(P<0.01);与ConA组和Control组相比,hALR能显著增加CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例(P<0.01)和FoxP3 mRNA的表达(P<0.01),并且hALR能够解除ConA引起的Treg细胞周期G2/M期的阻滞(P<0.01)。此外,与ConA组和Control组相比,ConA+hALR组上清中TGF-β1和IL-10的浓度明显升高(P<0.01)。结论hALR可以通过诱导Treg细胞的增殖、分化以及促进TGF-β1和IL-10的产生,从而达到免疫抑制的作用。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 人外周血单个核细胞 调节性T细胞 细胞因子 细胞周期

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阻断肝再生增强因子表达对HepG2细胞转化生长因子-α及表皮生长因子受体表达的影响 被引量：5

3

作者 梁珊 孙航 +2 位作者 王新国 谢松丽 刘杞 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2009年第6期401-404,F0003,共5页

目的用RNA干扰技术阻断人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)表达,观察人肝癌细胞HepG2中转化生长因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α)及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR... 目的用RNA干扰技术阻断人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)表达,观察人肝癌细胞HepG2中转化生长因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α)及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达是否受影响,以阐明hALR在促进肝癌细胞生长的相关细胞因子网络中的作用。方法将构建好的人肝再生增强因子siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B分别转染至HepG2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,计算转染效率。免疫细胞化学法检测转染细胞中hALR表达,确定抑制效果。根据转染质粒的不同,将HepG2细胞分为3组:转染组(转染pSIALR-A)、阴性对照组(转染pSIALR-B)和空白组(未转染重组质粒)。放射免疫法检测阻断肝再生增强因子后各组细胞培养上清中TGF-α水平,Western blot法检测阻断肝再生增强因子后各组细胞EGFR蛋白的表达。结果转染组、空白组和阴性对照组TGF-α分别为(5.27±0.86)pg/ml、(7.92±2.65)pg/ml和(6.50±1.28)pg/ml,转染组与空白组、阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);EGFR相对表达量分别为0.946±0.136、1.115±0.606和1.131±0.509,转染组与空白组、阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论在促进肝癌细胞生长的细胞因子网络中,肝再生增强因子除了可以直接刺激肝癌细胞增殖外还可通过上调TGF-α及EGFR的表达水平参与肝癌的发生、发展。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 RNA干扰 转化生长因子-Α 表皮生长因子受体 肝癌细胞HEPG2

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人肝再生增强因子下调钙结合蛋白S100A11基因表达的研究 被引量：4

4

作者 邵凤娟 成军 +6 位作者 马英骥 洪源 郭江 王巧侠 杨倩 纪冬 王琳 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 2006年第1期42-45,共4页

目的探讨人肝再生增强因子(ALR)对钙结合蛋白S100A11启动子(S100A11p)转录的调节作用。方法利用生物信息学技术确定S100A11p区域,聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3S100A11p报告载体;以该质粒转染HepG... 目的探讨人肝再生增强因子(ALR)对钙结合蛋白S100A11启动子(S100A11p)转录的调节作用。方法利用生物信息学技术确定S100A11p区域,聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3S100A11p报告载体;以该质粒转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,并以人ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)ALR共转染的HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAT的表达活性。结果pCAT3S100A11p在HepG2细胞中具有CAT的表达活性;以pcDNA3.1(-)ALR和pCAT3S100A11p共转染HepG2细胞,CAT表达活性是单独转染细胞组pCAT3S100A11p的0.42倍。结论所克隆的S100A11启动子有启动子的转录活性,ALR的转基冈表达具有对S100A11基因的下调作用。 展开更多

关键词 人肝细胞再生增强因子 S100A11启动子 基因表达 钙结合蛋白

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人肝再生增强因子融合蛋白表达载体的构建 被引量：2

5

作者 杨林 张阳德 +3 位作者 刘晓冬 黄秋林 贾晓巍 刘勤 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2002年第6期1-2,共2页

目的 :克隆人肝再生增强因子的cDNA并构建谷胱甘肽巯基转移酶 -人肝再生增强因子 (GST -hALR)融合蛋白表达载体。方法 :根据人肝再生增强因子核苷酸序列 ,从人胎肝cDNA文库中扩增到hALRcDNA ,亚克隆于pUC18载体 ,核苷酸序列测定证实为hA... 目的 :克隆人肝再生增强因子的cDNA并构建谷胱甘肽巯基转移酶 -人肝再生增强因子 (GST -hALR)融合蛋白表达载体。方法 :根据人肝再生增强因子核苷酸序列 ,从人胎肝cDNA文库中扩增到hALRcDNA ,亚克隆于pUC18载体 ,核苷酸序列测定证实为hALR ;将hALRcDNA亚克隆于 pGEX - 4T质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性克隆酶切鉴定。结果 :重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入相应酶切位点 ,片段与PCR扩增片段大小相同 ,碱基序列正确。结论 :GST -hALR融合蛋白表达载体的成功构建 。 展开更多

关键词 肝再生 人肝再生增强因子 融合基因载体 人肝再生增强因子融合蛋白表达载体 肝功能衰竭 基因工程产品 治疗

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微囊化和基因修饰的肝细胞移植——人肝再生增强因子(hALR)的原核表达、纯化及生物活性研究 被引量：3

6

作者 张阳德 赵劲风 +2 位作者 杨林 刘晓冬 陈伟 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2003年第5期1-5,9,共6页

目的 :构建人肝再生增强因子原核融合表达载体 ,并对表达产物进行生物活性研究 ,从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据 ,并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础。方法 :以pGEM -T -hALR为模板 ,应用PCR技术扩增... 目的 :构建人肝再生增强因子原核融合表达载体 ,并对表达产物进行生物活性研究 ,从而为hALR基因修饰的肝细胞移植的细胞来源研究提供实验依据 ,并为人肝再生增强因子的临床应用奠定基础。方法 :以pGEM -T -hALR为模板 ,应用PCR技术扩增出hALRcDNA ,克隆入原核融合表达载体pGEX - 4T - 2 ,限制性内切酶酶切及测序证实序列正确 ;转化大肠杆菌JM10 9:挑取阳性克隆以IPTG诱导表达融合蛋白GST -hALR ,融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化后进行凝血酶酶切获得hALR单体 ;采用3 H -thymidine渗入法检测hALR单体的生物学活性。结果 :以 pGEM -T -hALR为模板 ,行PCR扩增后 ,产物于1.5 %琼脂糖凝胶电泳分析 ,可见 380bp特异性条带 ,符合hALRcDNA阅读框架的大小。构建融合蛋白GST-hALR的重组表达质粒pGEX - 4T - 2 -hALR ,经限制性内切酶酶切分析 ,与理论值相符 ,测序证明序列正确 ,片段为正向插入。重组表达质粒转化人肠杆菌JM 10 9。SDS -PAGE电泳分析显示重组菌在约 4 1KD处出现一蛋白条带。纯化、酶切后融合蛋白前体谷胱甘肽S -转移酶约 2 6KD ,hALR约 15KD。薄层扫描蛋白电泳结果表明 ,表达的融合蛋白占细菌可溶性蛋白总量的 31%。纯化hALR加入原代鼠肝细胞、HepG2 细胞培基 。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 基因重组 融合蛋白 转化 纯化 生物活性 诱导表达

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抗人肝再生增强因子单克隆抗体对人肝癌细胞株HepG2增殖活性的影响 被引量：2

7

作者 唐琳 孙航 +4 位作者 张林 郭晖 陈雪华 邓建川 刘杞 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2005年第5期633-635,643,共4页

目的:检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达,利用hALR特异性的单克隆抗体(anti-hALR McAb)结合hALR,观察其阻断hALR的作用后,对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖活性的影响。方法:用免疫细胞化学以及RT-PCR的方法检测... 目的:检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达,利用hALR特异性的单克隆抗体(anti-hALR McAb)结合hALR,观察其阻断hALR的作用后,对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖活性的影响。方法:用免疫细胞化学以及RT-PCR的方法检测HepG2细胞hALR蛋白及mRNA的表达;用3H-TdR掺入法检测hALR特异性单克隆抗体中和hALR后HepG2细胞的增殖情况。结果:①HepG2细胞有hALR的表达。②抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后可部分抑制肿瘤细胞自主性生长。结论:抗hALR单克隆抗体能部分抑制肿瘤细胞自主性生长;hALR通过自分泌方式参与了肝癌细胞的自主性生长。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 单克隆抗体 肝癌 细胞株

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人肝再生增强因子CXXC结构域与生物学活性的关系 被引量：1

8

作者 潘艳 鞠桂芝 +1 位作者 佟明华 孔祥平 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期1000-1003,共4页

目的:初步探讨人肝再生增强因子蛋白(human augmenter of liver regeneration protein,hALRp)CXXC结构域与生物学活性的关系。方法:根据酶催化反应中巯基浓度的变化,测定目的蛋白巯基氧化酶活性;采用GST-pulldown方法测定目的蛋白与GST-... 目的:初步探讨人肝再生增强因子蛋白(human augmenter of liver regeneration protein,hALRp)CXXC结构域与生物学活性的关系。方法:根据酶催化反应中巯基浓度的变化,测定目的蛋白巯基氧化酶活性;采用GST-pulldown方法测定目的蛋白与GST-Na+,K+-ATPase融和蛋白体外相互作用;用MTT法检测目的蛋白促进成人肝细胞HL-7702增殖情况;探讨hALR与hALR-C65A(hALRp的CXXC结构域突变)蛋白活性差异。结果:在巯基氧化酶活性实验中,酶活性以转换数(TN)表示,hALR组TN=1.25±0.21,而hALR-C65A组TN=0,与hALR组比较差异有显著性(P<0.05)。但hALR-C65A与GST-Na+,K+-ATPase融和蛋白体外相互作用和促进肝细胞增殖活性与hALRp比较无明显变化。结论:hALRp的CXXC结构在巯基氧化酶活性方面有重要作用,但该结构改变并不影响hALRp与Na+,K+-ATPase的相互作用和促进肝细胞增殖活性。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 突变体 GST结合实验

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重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定 被引量：1

9

作者 邓建川 陈曜 +1 位作者 孙航 刘杞 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2007年第3期229-231,235,共4页

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定。方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序。利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载... 目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定。方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序。利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒。结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同。结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 原核表达 pQE30

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人肝再生增强因子DNA免疫的实验研究

10

作者 石小枫 刘杞 +1 位作者 马华锋 罗娅 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2002年第2期113-115,共3页

目的:构建人肝再生增强因子()真核表达质粒,免疫家兔,获得抗多抗血清。hALRhALR方法:将已构建的人肝再生增强因子()重组质粒,经扩增,亚克隆入真核表达质粒,构建重hALR PET11-hALRPCR pcDNA3.1 pcDNA3.1-hALR组质粒。中量制备重组质粒及... 目的:构建人肝再生增强因子()真核表达质粒,免疫家兔,获得抗多抗血清。hALRhALR方法:将已构建的人肝再生增强因子()重组质粒,经扩增,亚克隆入真核表达质粒,构建重hALR PET11-hALRPCR pcDNA3.1 pcDNA3.1-hALR组质粒。中量制备重组质粒及对照质粒,以只免疫家兔,取血并分离血清,进行蛋白质pcDNA3.1-hALR pcDNA3.11.08mg/印迹分析。Western blot结果:构建了真核表达质粒,此重组质粒诱发了家兔抗抗体的产生。pcDNA3.1-hALRhALR结论:说明构建的重组质粒在体内有表达能力,为进一步研究的生物学活性及某些疾病的治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 DNA免疫 WESTERN BLOT

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人肝再生增强因子对IL-10分泌的影响 被引量：1

11

作者 王新国 袁建国 刘杞 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期770-771,775,共3页

目的观察人肝再生增强因子对IL-10分泌的影响。方法用梯度离心法分离正常人PBMC,分成正常组、hALR组、ConA刺激组和ConA+hALR组。培养16h后,用MTT法观察细胞增殖情况,双抗夹心酶联法检测上清中细胞因子IL-2,IL-10水平。结果 ALR显著抑制... 目的观察人肝再生增强因子对IL-10分泌的影响。方法用梯度离心法分离正常人PBMC,分成正常组、hALR组、ConA刺激组和ConA+hALR组。培养16h后,用MTT法观察细胞增殖情况,双抗夹心酶联法检测上清中细胞因子IL-2,IL-10水平。结果 ALR显著抑制ConA对细胞的增殖作用的同时,明显促进细胞因子IL-10分泌和显著抑制细胞因子IL-2分泌。结论 ALR可能通过分泌IL-10和抑制IL-2分泌而发挥免疫抑制作用。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 IL-2 IL-10 PBMC

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利用噬菌体随机肽库筛选人肝再生增强因子特异结合肽及其抗肝癌作用的研究

12

作者 冯倩 刘燕倩 +1 位作者 孙航 刘杞 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期568-573,共6页

目的利用噬菌体随机肽库筛选人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)特异结合肽并研究其抗肝癌作用。方法以hALR为靶分子,利用Ph.D.TM噬菌体肽展示系统筛选出与hALR特异性结合的单克隆噬菌体,ELISA法鉴定筛选出... 目的利用噬菌体随机肽库筛选人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)特异结合肽并研究其抗肝癌作用。方法以hALR为靶分子,利用Ph.D.TM噬菌体肽展示系统筛选出与hALR特异性结合的单克隆噬菌体,ELISA法鉴定筛选出的单克隆噬菌体与hALR的结合性,对特异性结合噬菌体DNA中插入片段进行PCR扩增、测序及短肽合成,MTS法检测特异结合肽对人HepG2肝癌细胞增殖的影响,观察特异结合肽对裸鼠人HepG2肝癌移植瘤生长的影响。结果经过3轮生物淘筛,特异性结合噬菌体得到富集;筛选到的单克隆噬菌体与hALR结合具有特异性(与对照组比较P<0.05);特异结合肽在体外能抑制人HepG2肝癌细胞增殖(24 h抑制率为46.2%vs 6.5%,P<0.01;48 h抑制率为23.6%vs 5.9%,P<0.05),在体内能抑制裸鼠人HepG2肝癌移植瘤生长[(1.250±0.512)cm3vs(4.590±0.398)cm3,P<0.01;(1.100±0.453)g vs(3.794±0.299)g,P<0.01];该特异结合肽免疫小鼠后机体内无相应抗体检出,且对裸鼠的重要脏器组织结构及功能无明显损害。结论利用噬菌体肽库筛选到hALR特异结合肽,该短肽通过阻断hALR促肝癌细胞增殖作用,能抑制人HepG2肝癌细胞在体内外增殖,达到抗肝癌的作用,同时产生较低的免疫原性及毒性损害。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 特异结合肽 噬菌体肽库 肝癌 靶向治疗

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重组人肝再生增强因子基因转染肝细胞系的增殖活性研究

13

作者 吴贻琛 关崇丹 +7 位作者 刘鸿凌 游绍莉 刘晓燕 苏海滨 万志红 胡瑾华 貌盼勇 辛绍杰 《中国肝脏病杂志（电子版）》 CAS 2016年第1期57-61,共5页

目的研究重组人肝再生增强因子(hALR)转染肝细胞系的生物学活性,为生物人工肝细胞反应器提供合适的细胞材料。方法本研究采用转染重组质粒pcDNA3.1(-)hALR的HepG2细胞,经G418筛选,在体外培养、传代后,进行Western blot免疫印迹实验及免... 目的研究重组人肝再生增强因子(hALR)转染肝细胞系的生物学活性,为生物人工肝细胞反应器提供合适的细胞材料。方法本研究采用转染重组质粒pcDNA3.1(-)hALR的HepG2细胞,经G418筛选,在体外培养、传代后,进行Western blot免疫印迹实验及免疫荧光实验,检测细胞中hALR的表达,并与未转染重组质粒的HepG2细胞进行比较;采用ELISA方法,检测两组细胞培养液中hALR的分泌情况;使用流式细胞仪检测细胞中增殖细胞相关核抗原Ki-67,了解重组质粒转染前后HepG2细胞的增殖状况。结果转染重组质粒pcDNA3.1(-)hALR的HepG2细胞功能稳定,形态良好,细胞表达及分泌hALR较未转染重组质粒的HepG2细胞多,且随着培养时间的延长,细胞培养液中的hALR含量迅速升高,优于未转染重组质粒的HepG2细胞;转染重组质粒的HepG2细胞中Ki-67阳性细胞计数显著高于未转染重组质粒的HepG2细胞,说明转染重组质粒使肝细胞增殖活跃。结论本研究结果表明,前期研究构建的转染了hALR基因的肝细胞系能较高表达hALR,且细胞增殖活跃。 展开更多

关键词 肝再生增强因子 HEPG2细胞 生物活性

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重组人肝脏增生因子克隆表达纯化及生物活性的探讨

14

作者 曾晓波 苏先狮 《中国基层医药》 CAS 2008年第11期1838-1840,1939,共4页

目的构建人肝脏再生增强因子（hALR）原核表达载体，为基因工程大量制备hALR提供基础。方法构建hALR表达载体pGEX-3X-hALR，诱导表达GST—hALR，用GST Agawse柱亲和层析，再用Xa因子切除GST得到hALR蛋白；进一步用MTF法及动物实验检测h... 目的构建人肝脏再生增强因子（hALR）原核表达载体，为基因工程大量制备hALR提供基础。方法构建hALR表达载体pGEX-3X-hALR，诱导表达GST—hALR，用GST Agawse柱亲和层析，再用Xa因子切除GST得到hALR蛋白；进一步用MTF法及动物实验检测hALR活性。结果成功地构建了hALR表达载体pGEX-3X-hALR，并纯化出hALR蛋白；体外细胞实验及动物实验结果与文献报道相反。 展开更多

关键词 人肝脏增生因子 克隆 分子 蛋白纯化 活性检测

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人肝再生增强子原核表达系统的构建与筛选

15

作者 俞海英 刘骏 +1 位作者 李君 盛吉芳 《浙江预防医学》 2007年第3期5-6,18,共3页

目的构建多个人肝再生增强子(hALR)的原核表达系统进行原核表达、鉴定及筛选,得出理想的系统用于进一步的研究。方法构建4个重组表达质粒pET28a(+)/hALR、pET23a/hALR、pGEX-5x-1/hALR、pGEX-5x-2/hALR,分别转化3种宿主菌,诱导表达重组h... 目的构建多个人肝再生增强子(hALR)的原核表达系统进行原核表达、鉴定及筛选,得出理想的系统用于进一步的研究。方法构建4个重组表达质粒pET28a(+)/hALR、pET23a/hALR、pGEX-5x-1/hALR、pGEX-5x-2/hALR,分别转化3种宿主菌,诱导表达重组hALR蛋白,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westem blotting鉴定重组蛋白。结果双酶切和DNA测序证实hALR cDNA正确插入4种表达载体并成功转化宿主菌,仅pET28a(+)/hALR的BL21(DE3)菌株成功表达相对分子质量为23kDa的重组蛋白。结论筛选得出人肝再生增强子的原核表达系统,成功表达并鉴定重组hALR蛋白。 展开更多

关键词 人肝再生增强子 原核表达系统 筛选

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人肝再生增强因子基因的克隆和真核表达载体的构建

16

作者 李雪梅 赵春丽 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期85-88,共4页

从6月龄流产的胎儿肝脏中提取总RNA,利用反转录-PCR(RT-PCR)技术扩增出人肝细胞再生增强因子hALR(Human augmenter of liver regeneration)基因片段,克隆于PET28a(+)载体,经进一步PCR及酶切鉴定,确定为此目的片段后进行序列分析,再将目... 从6月龄流产的胎儿肝脏中提取总RNA,利用反转录-PCR(RT-PCR)技术扩增出人肝细胞再生增强因子hALR(Human augmenter of liver regeneration)基因片段,克隆于PET28a(+)载体,经进一步PCR及酶切鉴定,确定为此目的片段后进行序列分析,再将目的片段亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切方法鉴定重组子。采用RT-PCR技术成功地获得了hALR基因片段。序列分析表明,克隆的hALR基因与Genbank报道的人ALR核苷酸序列基本一致。完成了真核表达载体的构建,为hALR基因的真核表达奠定了基础。 展开更多

关键词 人肝再生增强因子 克隆 序列分析 真核表达载体

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人肝细胞再生增强因子双顺反子表达载体的构建及表达

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作者 马玉珍 任宇 +2 位作者 白红梅 王赛璐 云志中 《内蒙古大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2019年第5期518-523,共6页

PCR扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,将其插入质粒pIRES2-EGFP多克隆位点中,构建成新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为... PCR扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,将其插入质粒pIRES2-EGFP多克隆位点中,构建成新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为双顺反子的真核表达载体pAIE.另外体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(Sheep fetal fibroblast cells,sFFCs),脂质体lipofectAMINETM介导pAIE转染sFFCs,经过筛选后形成单克隆细胞,RT-PCR和免疫组化方法进一步检测ALR基因的表达.进一步将转基因细胞饥饿培养,体外成熟培养绵羊卵母细胞146个,进行体细胞核移植,经融合、激活后,在培养液中进行发育培养,对发育到8细胞胚胎在激光共聚焦显微镜下观察;同时利用免疫组化检测ALR基因在胚胎中的表达.结果表明:由IRES连接的EGFP和ALR基因在sFFCs内同时存在并表达;得到45个8细胞体细胞克隆胚胎,其中14个发育形成囊胚,EGFP和ALR基因在体细胞克隆胚胎中同时存在并表达.因此由IRES连接标记基因和目的基因,以标记基因指示目的基因的表达,可减少检测目的基因的繁琐手段,可得到高纯度表达ALR基因的转基因细胞和胚胎,为生产药用蛋白治疗肝脏疾病奠定实验基础. 展开更多

关键词 双顺反子真核表达载体 增强型绿色荧光蛋白 人肝细胞再生增强因子

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人肝再生增强因子真核表达及其对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响

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作者 郑钰 李小芳 +1 位作者 孙航 刘杞 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1065-1070,共6页

目的:构建人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,h ALR)15k D亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂(Cisplatin,DDP)诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法:用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法和基... 目的:构建人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,h ALR)15k D亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂(Cisplatin,DDP)诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法:用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法和基因重组技术,从重组质粒p PIC9K-rh ALR中扩增出编码rh ALR基因片段,将其克隆入p PICZαA质粒中构建重组质粒p PICZα-A-rh ALR。重组质粒SacⅠ酶切线性化后电转入酵母GS115中,并在1%的甲醇诱导下表达。表达上清蛋白经Western blot(ALR多克隆抗体和His-tag标签抗体)鉴定和镍柱亲和层析纯化。MTS试剂检测rh ALR体外对人肝癌细胞(Hep G2、QGY)的促增殖活性,及流式细胞仪检测rh ALR在顺铂诱导QGY细胞凋亡中的抗凋亡作用。结果:PCR、双酶切、DNA测序均鉴定重组质粒构建与预期一致。分泌表达的rh ALR约占上清总蛋白的70%,目的分子量约17 k D,Western blot均可见单一条带。纯化后的rh ALR对Hep G2和QGY的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强(Hep G2组:F=246.729,P=0.000;QGY组:F=246.004,P=0.000),且在QGY细胞顺铂诱导凋亡时也发挥着浓度梯度式抗凋亡作用(F=101.061,P=0.000)。结论:成功构建高效分泌表达rh ALR的p PICZα-A-rh ALR GS115真核表达系统;体外实验证实rh ALR对顺铂诱导人肝癌细胞有呈浓度依赖性的抗凋亡作用。 展开更多

关键词 肝再生增强因子 酵母表达 生物学活性 镍柱亲和层析

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重组人肝再生增强因子对肝纤维化大鼠金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的影响 被引量：19

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作者 王爱民 杨晓明 +3 位作者 王文犀 左凤亭 王清明 贺福初 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第9期610-612,共3页

目的　了解重组人肝再生增强因子 (hALR)对实验性肝纤维化大鼠肝组织金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP1)基因表达的影响。方法　我们建立了四氯化碳中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型 ,在造模的同时给予不同剂量的hALR... 目的　了解重组人肝再生增强因子 (hALR)对实验性肝纤维化大鼠肝组织金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP1)基因表达的影响。方法　我们建立了四氯化碳中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型 ,在造模的同时给予不同剂量的hALR。在不同的时间点留取大鼠肝组织标本 ,提取总RNA ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)测定TIMP1的基因表达水平。结果　在两种模型中大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平在模型形成过程中逐渐升高 ;低剂量hALR组大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平与模型组及阴性对照组差异无显著意义 ;高剂量hALR组大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平 (四氯化碳模型第 2、4、6、8周分别为 0 6 3± 0 10、1 18± 0 2 0、1 89± 0 30、2 6 3± 0 33;人血白蛋白模型尾静脉攻击中、攻击后分别为 2 33± 0 36、4 0 2± 0 5 3)均明显低于模型组 (四氯化碳模型第 2、4、6、8周分别为 0 99± 0 14、2 0 3± 0 30、2 99± 0 4 3、4 13± 0 4 4 ;人血白蛋白模型尾静脉攻击中、攻击后分别为 4 13± 0 6 0、5 99± 0 83)及阴性对照组。 展开更多

关键词 重组人肝再生增强因子 肝纤维化 大鼠 金属蛋白酶组织抑制因子-1 基因表达

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人肝再生增强因子阅读框的cDNA克隆和序列分析 被引量：14

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作者 刘杞 王志毅 +2 位作者 罗娅 黄爱龙 张定凤 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 1999年第3期155-158,共4页

目的获取人肝再生增强因子（ＡＬＲ）阅读框的ｃＤＮＡ克隆，为进一步研究打下基础。方法从人胎肝中提取总ＲＮＡ作为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录台成第一链ｃＤＮＡ，用我们设计的引物和ＰＣＲ方法扩增双链ｃＤＮＡ。ＰＣＲ产物约３... 目的获取人肝再生增强因子（ＡＬＲ）阅读框的ｃＤＮＡ克隆，为进一步研究打下基础。方法从人胎肝中提取总ＲＮＡ作为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录台成第一链ｃＤＮＡ，用我们设计的引物和ＰＣＲ方法扩增双链ｃＤＮＡ。ＰＣＲ产物约３８０ｂｐ并被亚克隆人ｐＵＣ１９，经测序和ＰＣＧＥＮＥ软件分析。结果获得人ＡＬＲ完整阅读框的ｃＤＮＡ片段，长度为３７８ｂＰ。与大鼠ＡＬＲ和最近报道的人ＡＬＲ序列比较同源性分别为８６、５％和９９．２％。结论成功地克隆人ＡＬＲ完整阅读框的ｃＤＮＡ，同时提示人ＡＬＲ参与了人胎儿晚期发育过程中胎肝的生长调节。 展开更多

关键词 人 肝再生增强因子 阅读框 CDNA 克隆

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