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棉花角斑病菌hpaXm基因突变体与互补载体构建 被引量：1
1
作者 王慕瑾 刘悦 +2 位作者 孙超 缪卫国 郑服丛 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期75-81,共7页
为了分析研究Harpin蛋白转运途径,针对来自棉花角斑病菌的HpaXm,构建hpaXm基因突变体和互补载体,根据文献和GenBank中已登录的hpaXm基因全序列及其同源基因hpa1的序列,设计合成多对引物进行PCR扩增,并将扩增片段与载体相连接,用电转化... 为了分析研究Harpin蛋白转运途径,针对来自棉花角斑病菌的HpaXm,构建hpaXm基因突变体和互补载体,根据文献和GenBank中已登录的hpaXm基因全序列及其同源基因hpa1的序列,设计合成多对引物进行PCR扩增,并将扩增片段与载体相连接,用电转化的方式将构建成功的hpaXm基因敲除载体转化Xanthmonas citri subsp.malvacearum,然后测定hpaXm基因突变体在烟草上激发HR的能力。结果得到hpaXm基因上游序列349 bp,hpaXm基因下游序列465 bp;利用重叠PCR将hpaXm基因上下游序列融合,克隆到自杀载体pK18mob的酶切位点BamHI和EcoRI之间,并将pK18mobhpaXm上下游融合片段转化大肠杆菌E.coli DH5α,经卡那霉素平板筛选得到阳性转化子;将hpaXm基因敲除载体转化X.citri subsp.malvacearum,经PCR验证成功敲除hpaXm基因,并发现hpaXm基因突变体在烟草上激发HR的能力要弱于野生型菌株。扩增得到hpaXm基因片段402 bp和信号肽类似序列缺失hpaXm46-402基因片段360 bp,克隆到广宿主载体pHM1的KpnI和SacI酶切位点之间,并将pHM1hpaXm和pHM1hpaXm46-402转化E.coli DH5α,经壮观霉素平板筛选得到阳性转化子。重组质粒经PCR检测、测序鉴定及突变体在烟草上的表型验证,表明hpaXm基因突变体和互补载体构建成功,为hpaXm基因回复突变株的构建和进一步研究信号肽序列缺失对HpaXm蛋白转运的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 hpaxm 信号肽类似序列 突变体 互补载体
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2种harpin内源表达对短短芽孢杆菌HAB-5菌株抑制和促生能力的影响 被引量：2
2
作者 汪惠 谢琳琳 +3 位作者 刘文波 林春花 缪卫国 郑服丛 《江苏农业科学》 北大核心 2015年第11期161-166,共6页
采用化学方法分别将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、棉花角斑病菌(X.citri subsp.malvacearum)hrp基因簇中的hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因转化至生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevs)HAB-5菌株,测定2种harpin蛋白... 采用化学方法分别将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、棉花角斑病菌(X.citri subsp.malvacearum)hrp基因簇中的hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因转化至生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevs)HAB-5菌株,测定2种harpin蛋白对短短芽孢杆菌抑菌和促生能力的影响,以期获得更高效的生防菌株。结果表明,获得转入hpa1_(Xoo)的突变体581个,转入hpa_(Xm)的突变体有650个;经PCR及PCR Southern Blot验证,确定hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因均成功转化至HAB-5菌株中;经SDS-PAGE电泳,在分子量大小约39、41 ku处可见明显条带,表明hpa1_(Xoo)、hpa_(Xm)基因分别编码的融合蛋白GST-harpin Xoo、GST-harpin Xm在突变体菌株中得到表达;与出发菌株HAB-5菌株相比,转化后的突变体在菌落形态、拮抗活性上均发生了改变,且突变体总蛋白可在烟草叶片上激发过敏性反应,而HAB-5菌株总蛋白不能激发过敏性反应;突变体菌株对番茄种子的促生作用显著提高,且转入hpa_(Xm)基因的菌株效果更佳,使胚芽、胚根的生长分别提高100.77%、69.14%。可见,harpin能够在短短芽孢杆菌HAB-5菌株中得到表达,且转化后的突变体表现出良好的促生效果。 展开更多
关键词 hpa1Xoo hpaxm 转化 短短芽孢杆菌HAB-5 过敏性反应
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转hpaXm烟草及其对TMV抗病性分析
3
作者 李乐 缪卫国 +2 位作者 郑服丛 刘文波 谢琳琳 《热带生物学报》 2015年第4期449-459,共11页
从棉花角斑病菌(Xanthomonas citri subsp.malvacearum)中克隆并鉴定出的hpaXm是一类新的harpin蛋白。笔者首次将来自棉花角斑病菌的hpaXm基因采用农杆菌介导法导入模式生物三生烟(Nicotiana tobacum‘Xanthi nc.’),获得转基因烟草,并... 从棉花角斑病菌(Xanthomonas citri subsp.malvacearum)中克隆并鉴定出的hpaXm是一类新的harpin蛋白。笔者首次将来自棉花角斑病菌的hpaXm基因采用农杆菌介导法导入模式生物三生烟(Nicotiana tobacum‘Xanthi nc.’),获得转基因烟草,并通过分子鉴定和蛋白活性测定,研究hpa Xm的内源表达对转基因烟草的影响。结果表明:PCR扩增检测到T_1代烟草阳性植株的靶基因序列及35S启动子序列,Southern blot检测结果证明hpaXm基因已经整合到受体基因组中,RT-PCR结果显示在转录水平上正常表达。从转hpaXm基因烟草中分别提取可溶性蛋白能激发烟草产生过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白。hpaXm的内源表达虽不能使转基因烟草产生大面积可见的坏死斑,但经台酚蓝染色后能观察到微过敏反应现象,同时hpaXm能诱导转基因烟草对烟草花叶病毒(TMV)产生抗性。本研究对于探索hpaXm在转基因作物中所诱导的生物学特性提供科学依据。 展开更多
关键词 HPA Xm 转基因烟草 过敏性反应(HR) TMV抗性
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转hpa1Xm基因烟草后代的分子检测及苗期生理生化指标测定 被引量：1
4
作者 刘晓 金洋 +5 位作者 冯霞 康迅 刘文波 林春花 缪卫国 郑服丛 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期1732-1737,共6页
本研究以野生型三生烟(Nicotiana tabacum cv.Xanthi nc.)及T_2、T_3代转hpa Xm(即hpa1Xm)基因烟草和转hpa Xm N-端缺失突变体(标记为hpa Xm△LP)烟草为试材,对目标基因的整合表达、叶绿素含量及防御酶活性进行检测。结果表明,卡那霉素... 本研究以野生型三生烟(Nicotiana tabacum cv.Xanthi nc.)及T_2、T_3代转hpa Xm(即hpa1Xm)基因烟草和转hpa Xm N-端缺失突变体(标记为hpa Xm△LP)烟草为试材,对目标基因的整合表达、叶绿素含量及防御酶活性进行检测。结果表明,卡那霉素抗性筛选、PCR及RT-PCR检测证明,外源目的基因hpa Xm和hpa Xm△LP整合到烟草基因组中,在转录水平上正常表达,且两个世代中稳定遗传。叶绿素含量测定中,转基因烟草含量显著高于野生型植株,同种转基因植株T_2代含量显著高于T_3代,而转hpa Xm基因烟草的总叶绿素含量比转hpa Xm△LP基因烟草的高,无显著性差异。防御酶活性的测定,表明转基因烟草的PAL、POD和PPO活性皆显著高于野生型植株;而转hpa Xm基因烟草的PAL和POD活性显著高于转hpa Xm△LP基因烟草;同品种转基因烟草中,T_2代PAL活性显著高于T_3代。说明hpa1Xm基因在烟草中表达能显著提高其叶绿素含量及抗病防御酶活性水平,且不同世代的转基因烟草之间表现有所差异。初步探索了hpa Xm的功能、遗传稳定性及信号肽类似序列对hpa Xm的表达及功能的影响。 展开更多
关键词 转hpaxm基因烟草 转hpaxm△LP基因烟草 叶绿素含量 防御酶活性
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