基因工程药物中宿主细胞蛋白的检测与控制 被引量：5

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作者 王志明 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第22期2550-2557,共8页

宿主细胞蛋白(host cell proteins,HCPs)是基因工程菌株或细胞株自身产生的与基因工程目的产物无关的蛋白混合物,其中有些蛋白是工程菌株或细胞株生存、繁殖及其他正常生理活动所必须的,其在产品生产过程与目的产物共同纯化且不能被去除... 宿主细胞蛋白(host cell proteins,HCPs)是基因工程菌株或细胞株自身产生的与基因工程目的产物无关的蛋白混合物,其中有些蛋白是工程菌株或细胞株生存、繁殖及其他正常生理活动所必须的,其在产品生产过程与目的产物共同纯化且不能被去除。HCP的组成与丰度在生产的各个阶段与最终产品都各自不同,其决定于许多不同因素。ELISA(enzyme-linked-immunosorbent assay)是HCP定量检测中最常用的分析手段,但是由于依赖于特异性抗体的产生,在许多情况下也限制了该方法的检测应用。可视化检测技术(如双向差异凝胶电泳)与定性检测技术(如质谱分析)成为ELISA检测的有力验证与补充。对HCP及其产生机制越来越深入的理解有助于我们设计基因工程药物的生产过程(从上游细胞系的选择到下游纯化手段的选择),从而降低或去除最终产品中的HCP。 展开更多

关键词 宿主细胞蛋白 组成和丰度 酶联免疫吸附检测 双向差异凝胶电泳 质谱 细胞工程

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单抗制品中CHO细胞宿主蛋白残留双抗夹心ELISA检测方法的建立 被引量：5

2

作者 柯志 周冬梅 +3 位作者 徐军 杨彬 苏彦景 孙文正 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第8期837-840,共4页

目的建立单抗制品中CHO细胞宿主蛋白（host cell protein,HCP）残留双抗夹心ELISA检测方法。方法确定双抗夹心ELISA方法的最佳工作条件,并对该方法的精密度和准确度进行验证,确定线性范围及最低检出限;用建立的方法与市售试剂盒分别检... 目的建立单抗制品中CHO细胞宿主蛋白（host cell protein,HCP）残留双抗夹心ELISA检测方法。方法确定双抗夹心ELISA方法的最佳工作条件,并对该方法的精密度和准确度进行验证,确定线性范围及最低检出限;用建立的方法与市售试剂盒分别检测低、中、高浓度HCP标准品及抗TNF-α单抗原液、抗VEGF单抗纯化工艺样品中的HCP。结果建立的双抗夹心ELISA法最佳抗体包被浓度为1.5μg/ml,酶标抗体浓度为1μg/ml,160 r/min,37℃孵育2.5 h;TMB 37℃孵育15 min;以630 nm为参比波长,450 nm为测定波长。该方法的线性范围为3.125~100 ng/ml,最低检测限为3.125 ng/ml;试验内变异系数（CV）和试验间CV均小于15%,回收率为85.3%~115.1%。与商品化试剂盒检测结果基本一致,可用于检测纯化工艺样品。结论已成功建立单抗制品中CHO细胞HCP残留双抗夹心ELISA检测方法,该方法可代替市售试剂盒用于CHO细胞HCP残留检测,可使检测成本降低30倍。 展开更多

关键词 CHO细胞 宿主蛋白 双抗夹心酶联免疫吸附法

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生物制剂工艺特异性残留宿主蛋白ELISA检测方法的建立及验证

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作者 田易晓 王新月 +7 位作者 窦向雅 韩翠翠 高珂 邵东燕 段苏杨 白岳丘 赵雯 黄庆生 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第2期221-226,共6页

目的 建立基因重组生物制剂中工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法 以大肠埃希菌表达胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide,GLP)的生产与纯化工艺为特定工艺模型,采用同一工艺用于空载大肠埃希菌(... 目的 建立基因重组生物制剂中工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法 以大肠埃希菌表达胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide,GLP)的生产与纯化工艺为特定工艺模型,采用同一工艺用于空载大肠埃希菌(不表达重组蛋白的正常大肠埃希菌)残留蛋白的截取。将获得的残留蛋白作为免疫原分别免疫1只雌性新西兰白兔和6只雌性昆明小鼠,以兔免疫血清纯化IgG抗体为包被抗体,鼠免疫血清为第二夹心抗体,抗鼠IgG-HRP为酶标二抗,建立工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白双抗体夹心ELISA方法。对建立的方法进行特异性、准确性、精密性验证,并确定方法的检测限。同时采用建立的方法和市售大肠埃希菌宿主蛋白残留检测试剂盒对纯化的GLP制剂进行残留蛋白定量测定。结果 对已知浓度的工艺特异性残留蛋白进行系列梯度稀释后,建立的ELISA方法检测的灵敏度可达338 pg/mL;该方法检测CHO和酵母细胞裂解蛋白无交叉反应,检测低、中、高3个浓度样品的回收率均在80%~120%范围内,检测低、中、高浓度空载大肠埃希菌截留液标准品的试验内和试验间CV均<15%。针对GLP制剂中的残留蛋白,与建立的方法检出的GLP制剂中残留蛋白总量相比,约有62%的残留蛋白未被市售非工艺特异性ELISA试剂盒检出,这些残留蛋白应为本工艺特异的残留蛋白。结论 建立的双抗体夹心ELISA法检测工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白灵敏度高,特异性强,准确性和精密性良好,可满足残留蛋白在生物制剂中低于0.01%~0.1%标准的检测要求。 展开更多

关键词 工艺特异性 大肠埃希菌 宿主蛋白 酶联免疫吸附测定

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MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立 被引量：3

4

作者 罗剑 张敏 +3 位作者 周琳婷 李贝贝 刘旭平 谭文松 《微生物学免疫学进展》 2019年第4期1-6,共6页

目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein ... 目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度>90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50~2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%~111.9%之间,变异系数均<10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至<900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。 展开更多

关键词 犬肾(MDCK)细胞 宿主细胞蛋白 双抗体夹心酶联免疫吸附试验 流感疫苗

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重组人抗TNFα单抗制品中CHO宿主细胞蛋白质残留夹心ELISA检测方法的建立及验证 被引量：3

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作者 邓春平 梅雄 +2 位作者 陈航 何水华 刘翠华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第8期925-928,933,共5页

目的建立检测重组人抗TNFα单抗制品中CHO宿主细胞蛋白质(host cell protein,HCP)残留的夹心ELISA法,并进行验证。方法采用二维电泳-Western blot(2D-Western blot)法筛选兔抗CHO HCP多克隆抗体(产品号:AB000103-A、AB000103-C)及羊抗CH... 目的建立检测重组人抗TNFα单抗制品中CHO宿主细胞蛋白质(host cell protein,HCP)残留的夹心ELISA法,并进行验证。方法采用二维电泳-Western blot(2D-Western blot)法筛选兔抗CHO HCP多克隆抗体(产品号:AB000103-A、AB000103-C)及羊抗CHO HCP多克隆抗体(批号:3G-0016-PA)中识别重组人抗TNFα单抗特异性CHO HCP覆盖率最高的一种作为检测抗体,建立检测样品中残余HCP的夹心ELISA法,并验证方法的线性、基质干扰、稀释线性、灵敏度、精密度及准确性。结果以覆盖率达57%的AB000103-C号兔抗CHO HCP多克隆抗体作为检测抗体;样品基质干扰HCP检测,样品需稀释6倍;HCP标准品浓度在3.33~810 ng/mL范围与A450值曲线拟合良好,R2=1,试验内及试验间精密性验证的CV均小于12%,检测限及定量限分别为2.4和20 ng/mL;20、150及300 ng/mL的加标样品回收率分别为99.5%、97.1%及100.3%。结论成功建立了重组人抗TNFα单抗HCP残留的夹心ELISA检测方法,该方法灵敏度高,准确性、精密性及线性良好,适用于重组人抗TNFα单抗制品的残留HCP检测。 展开更多

关键词 重组人抗TNFα单抗 CHO细胞 宿主细胞蛋白质 酶联免疫吸附测定

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实验设计在重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺建立过程中的应用 被引量：2

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作者 毕江坤 俞露 +3 位作者 张宇 张五妮 李利 刘涵 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期336-340,共5页

目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化,以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 ... 目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化,以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 利用Minitab 19中DOE功能创建4因子2水平完全析因实验设计,通过DOE对rhGH-Fc纯化工艺中离子交换层析条件(流速、上样量、缓冲液pH、洗脱液盐浓度)进行优化,找出操作空间。结果 建立的DOE模型能准确预测实验结果,其中上样量、缓冲液pH、洗脱盐浓度以及缓冲液pH与洗脱液盐浓度的交互效应对收获液中HCP含量有显著影响。获得的最佳层析条件为:上样量15 mg/mL,流速120 cm/h,洗脱液pH 7.0~8.0,洗脱液盐浓度0.1 mol/L。该层析条件下洗脱液中HCP含量均<400 ng/mg,在确定操作空间的结果范围内满足验证要求。结论 本实验成功应用DOE确定了阴离子交换层析去除HCP的最佳层析条件,为其在生物制药领域的更多应用提供了参考。 展开更多

关键词 实验设计 重组人生长激素-Fc 宿主蛋白 纯化

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重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白残留测定试剂盒的适用性验证 被引量：2

7

作者 邓春平 杨波 +3 位作者 庄兰芳 李梦瑶 郑赞顺 曲伟 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期49-52,58,共5页

目的验证重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白(host cell protein,HCP)残留检测试剂盒的适用性。方法对淄博云桥生物技术有限公司制备的大肠埃希菌HCP的ELISA检测试剂盒进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,同时进行基质干扰试验和稀... 目的验证重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白(host cell protein,HCP)残留检测试剂盒的适用性。方法对淄博云桥生物技术有限公司制备的大肠埃希菌HCP的ELISA检测试剂盒进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,同时进行基质干扰试验和稀释回收试验。采用该试剂盒及一款市售进口试剂盒分别对本公司制备的3批重组碱性成纤维细胞生长因子(recombinant basic fibroblast growth factor,rbFGF)制品原液及纯化工艺中间样品的HCP残留量进行检测。结果试剂盒可特异性检测大肠埃希菌HCP残留量;线性范围为3.33~810 ng/ml;检测限和定量限均为3.33 ng/ml;试验内变异系数(CV)和试验间CV均<16%;低、中、高3个浓度样品的回收率分别为113.1%、113.7%和97.5%;原液样品基质对测定基本无影响,原液基质中DTT含量<5 mmol/L对测定结果的影响在可接受范围内;原液样品在测定HCP含量时存在干扰,稀释3倍时,干扰最小;该试剂盒与另一款市售试剂盒检测3批rbFGF制品原液及纯化工艺中间样品的HCP残留量基本一致。结论该试剂盒具有良好的特异性、灵敏度、准确性、精密度和线性,可用于本公司重组蛋白制品中大肠埃希菌HCP残留的检测。 展开更多

关键词 重组蛋白 大肠埃希菌 宿主蛋白 残留量 酶联免疫吸附测定 适用性

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两种阴离子交换层析填料去除重组全人源抗程序性死亡配体1单克隆抗体宿主蛋白能力及动态载量的比较 被引量：2

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作者 肖宏学 徐丁 +4 位作者 韦剑龙 韦俊彦 韦世全 苏龙 祁振强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第8期882-885,891,共5页

目的比较两种阴离子交换层析填料Capto Q和Eshmuno Q去除重组全人源抗程序性死亡配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)单克隆抗体宿主蛋白(host cell protein,HCP)的能力以及动态载量。方法采用AKTA avant 25层析系统,通过实验... 目的比较两种阴离子交换层析填料Capto Q和Eshmuno Q去除重组全人源抗程序性死亡配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)单克隆抗体宿主蛋白(host cell protein,HCP)的能力以及动态载量。方法采用AKTA avant 25层析系统,通过实验设计(design of experiment,Do E)考查上样量、pH和电导率3个工艺参数变量对HCP去除的影响,设计条件为上样量范围40~60 mg IgG/m L gel,pH范围6.6~7.4,电导率范围1~4 ms/cm,阴离子交换层析采用抗体穿透模式。结果在设计的工艺参数范围内,随着pH的增加和电导率的减小,HCP去除效果有上升趋势;随着pH的减小和电导率的增加,动态载量有上升趋势。在最佳操作范围内当pH=7.0,电导率=1 ms/cm时,Capto Q的HCP去除能力为0.01%,载量为45 mg/m L gel;Eshmuno Q的HCP去除能力为0.02%,载量为35 mg/m L gel。结论阴离子交换层析能有效去除PD-L1单抗的HCP,去除率达50倍以上,动态载量Eshmuno Q达35 mg/m L gel,Capto Q达45 mg/m L gel。 展开更多

关键词 单克隆抗体 抗程序性死亡配体1 宿主蛋白 动态载量 阴离子交换层析

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单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒的验证 被引量：1

9

作者 陈英 徐燕华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第2期211-213,共3页

目的对单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒进行验证。方法对Cygnus Technologies公司制备的SP2/0Host Cell Protein(sHCPs)ELISA试剂盒进行灵敏度、精密性验证及基质干扰试验和样品稀释回收试验,并采用该试剂盒对本... 目的对单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒进行验证。方法对Cygnus Technologies公司制备的SP2/0Host Cell Protein(sHCPs)ELISA试剂盒进行灵敏度、精密性验证及基质干扰试验和样品稀释回收试验,并采用该试剂盒对本公司制备的10批单抗制品原液及冻干品进行检测。结果标准蛋白含量的对数与相应的光吸收值的对数,在2～200ng/ml范围内呈线性关系;该试剂盒检测限可达0.6ng/ml,定量限可达2ng/ml,灵敏度符合要求;检测低、中、高3个浓度的SP2/0HCPs样品试验内及试验间变异系数分别为15.4%、3.0%、2.1%及12.0%、3.3%、1.5%;样品基质对检测无明显干扰;单抗样品检测不存在Hook效应;检测本公司10批单抗制品原液和冻干品中SP2/0细胞蛋白残留率均小于0.01%。结论该试剂盒灵敏度高,精密性好,可用于单抗制品中残余SP2/0细胞蛋白含量的测定。 展开更多

关键词 单克隆抗体 SP2/0细胞 宿主细胞蛋白 ELISA 验证

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Vero细胞HCP试剂盒的稳定性观察 被引量：1

10

作者 张月兰 马可 +6 位作者 赵玉秀 张晋梁 宏阳 马乐 牛志彬 赵硕 王辉 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第12期1216-1218,共3页

目的观察Vero细胞HCP试剂盒的稳定性。方法将Vero细胞HCP试剂盒分别于2～8℃和37℃放置不同时间,检测试剂盒的灵敏度、特异性、准确性及精密性。结果试剂盒在2～8℃放置10个月的特异性及灵敏度均较好;检测参考品的回收率在91.7%～114.8... 目的观察Vero细胞HCP试剂盒的稳定性。方法将Vero细胞HCP试剂盒分别于2～8℃和37℃放置不同时间,检测试剂盒的灵敏度、特异性、准确性及精密性。结果试剂盒在2～8℃放置10个月的特异性及灵敏度均较好;检测参考品的回收率在91.7%～114.8%之间;对不同制品检测结果的变异系数均小于10%。37℃放置7d,试剂盒的灵敏度仍可达12.5ng/ml;放置10d,检测参考品的回收率在85%～115%之间;对不同制品检测结果的变异系数均小于10%。结论Vero细胞HCP试剂盒于2～8℃放置10个月及37℃放置7d的稳定性较好,仍可正常使用。 展开更多

关键词 VERO细胞 hcp ELISA试剂盒 稳定性

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流感疫苗工艺特异性MDCK宿主蛋白ELISA检测方法的建立与应用

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作者 韩天 邓涛 +2 位作者 张哲罡 张家友 杨晓明 《微生物学免疫学进展》 CAS 2021年第6期29-37,共9页

目的建立一种能够检测MDCK细胞基质流感疫苗中宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)含量的双抗体夹心ELISA并进行验证。方法通过培养MDCK细胞获取工艺特异性的MDCK HCP,进一步处理获得参考品。将MDCK HCP分别免疫新西兰兔和波尔山羊获得... 目的建立一种能够检测MDCK细胞基质流感疫苗中宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)含量的双抗体夹心ELISA并进行验证。方法通过培养MDCK细胞获取工艺特异性的MDCK HCP,进一步处理获得参考品。将MDCK HCP分别免疫新西兰兔和波尔山羊获得抗HCP的多克隆抗体。抗体经纯化后进行SDS-PAGE分析,间接ELISA分析鉴定抗体效价并验证特异性,选择效价较高的兔抗体作为包被抗体,使用HRP标记羊抗体获得显示抗体,从而建立检测MDCK HCP的双抗体夹心ELISA。确定该方法所用抗体的工作浓度以及线性范围,验证准确性、重复性、中间精密度、耐用性和特异性。然后,使用该方法对生产过程中的样品进行检定,并将检测结果与商品试剂盒的检测结果进行比对。结果制备的HCP参考品相对分子质量分布在25000~80000之间,抗原质量浓度为31.74μg/mL。免疫新西兰兔和波尔山羊获得高质量抗体,抗体效价分别为1∶512000、1∶128000,纯化后的多抗特异性良好。选择抗体效价较高的兔抗体作为包被抗体,工作浓度较高的酶标羊抗作为显示抗体建立双抗体夹心ELISA。方阵滴定法确定了包被抗体工作质量浓度为4μg/mL,显示抗体的工作浓度为1∶3200,该方法在20~400 ng/mL范围内线性关系良好(R^(2)>0.99),不同浓度的MDCK HCP回收率在95.62%~113.82%之间,CV<10%,重复性和中间精密度结果的CV<10%,显示抗体孵育时间在0.5~1.5 h内对实验无影响,显色时间在10~20 min内对实验无影响,特异性良好。使用该方法对生产样品进行检测,与商用试剂盒的检测结果差异无统计学意义(P=0.236,P>0.05)。结论建立了能检测MDCK细胞基质流感疫苗中残留HCP的双抗体夹心ELISA,方法学验证结果良好,可用于MDCK细胞基质流感疫苗生产中残留HCP的检定,对疫苗生产质量控制具有重要意义。 展开更多

关键词 宿主细胞蛋白 MDCK细胞 工艺特异性 ELISA 质量控制

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