小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定 被引量：11

1

作者 董世武 应大君 +2 位作者 刘光久 朱楚洪 张伟 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第21期1947-1950,共4页

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装... 目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012)pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体。 展开更多

关键词 腺病毒 Osf2/Cbfal基因 同源重组

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人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定 被引量：7

2

作者 方针强 叶钢 +3 位作者 欧阳一辛 刘永亮 贾维胜 冯嘉瑜 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期153-156,共4页

目的构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况。方法用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,... 目的构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况。方法用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测。结果酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25×1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体。 展开更多

关键词 腺病毒 骨形成蛋白-7 同源重组

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细菌内同源重组法制备mIL-12腺病毒载体及其体外高效表达 被引量：6

3

作者 魏道严 唐展云 陈诗书 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 2000年第6期716-721,共6页

利用细菌内同源重组法构建含 m IL- 1 2双顺反子重组腺病毒载体 ,其中由 polio IRES连接的 m IL- 1 2 p40和 p35双亚基目的基因片段用 Not +Xho 酶自真核表达载体 pc DNA3/m IL- 1 2中切出 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒中 ,形... 利用细菌内同源重组法构建含 m IL- 1 2双顺反子重组腺病毒载体 ,其中由 polio IRES连接的 m IL- 1 2 p40和 p35双亚基目的基因片段用 Not +Xho 酶自真核表达载体 pc DNA3/m IL- 1 2中切出 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 p Adtrack- CMV/m IL- 1 2 ,对之线性化后与腺病毒基因组质粒 p Adeasy- 1共转化 BJ51 83菌 ,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒DNA,转染 2 93细胞 ,包装成重组体腺病毒 Ad- m IL - 1 2 . Southern杂交证实 ,p40和 p35基因已被克隆至 Ad- m IL - 1 2基因组中 ;RT- PCR结果显示 ,Ad- m IL- 1 2感染的 MM45T· Li肿瘤细胞中有p40和 p35基因的表达 ,ELISA检测感染 48h细胞的上清中 m IL- 1 2的含量达 88ng每 1 0 6细胞 ,其体外能刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖 ,提高 NK细胞活性及诱导 干扰素的产生 .结果表明 ,利用细菌内同源重组法制备的 Ad- m IL- 1 2重组腺病毒载体是一种方便、高效、成功率高的方法 ,所制备的重组体腺毒在体外能有效表达具有生物活性的 m IL- 1 2 ,为今后的体内应用奠定了基础 . 展开更多

关键词 腺病毒 白介素12 同源重组 细菌 载体 表达

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小鼠 noggin 基因的重组腺病毒构建与鉴定 被引量：7

4

作者 余资江 应大君 +3 位作者 董世武 张伟 崔晓萍 糜建红 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期51-54,共4页

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR ... 目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10^(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。 展开更多

关键词 腺病毒 noggin基因 同源重组

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人源分泌型血管内皮细胞生长因子受体flt-1(Ⅰ～Ⅳ/区)的基因克隆及其腺病毒载体的构建和表达 被引量：5

5

作者 张华 寿成超 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第4期625-630,共6页

肿瘤的生长、转移与血管形成密切相关 ,利用基因治疗的方法将抗血管形成的因子导入体内是目前肿瘤生物治疗研究的重要策略 .血管内皮细胞生长因子 (VEGF)在血管生成中起重要作用 ,因此阻断VEGF与相应受体的结合成为抗血管形成的重要靶... 肿瘤的生长、转移与血管形成密切相关 ,利用基因治疗的方法将抗血管形成的因子导入体内是目前肿瘤生物治疗研究的重要策略 .血管内皮细胞生长因子 (VEGF)在血管生成中起重要作用 ,因此阻断VEGF与相应受体的结合成为抗血管形成的重要靶点 .通过RT PCR从人脐静脉内皮细胞克隆了VEGF受体Flt 1的信号肽及胞外Ⅰ～Ⅳ区cDNA ,即可溶性sFlt 1的cDNA片段 .利用Ad Easy体系 ,在细菌BJ5 183中同源重组后 ,转染包装细胞 2 93,成功包装出重组flt 1腺病毒 ,利用它可有效地感染低分化胃黏液腺癌细胞株MGC80 3.经RT PCR ,免疫沉淀及免疫印迹等不同方法检测表明 ,被感染细胞能表达并分泌Flt 1的胞外区蛋白 ,为后续进行抗肿瘤血管形成的基因治疗研究奠定了基础 . 展开更多

关键词 人源分泌型血管内皮细胞生长因子受体 FLT-1 基因克隆 腺病毒载体 构建 表达 肿瘤

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重组腺病毒Ad-绿色荧光蛋白／干细胞白血病基因的构建及在Cajal间质细胞缺失模型鼠体内的分布和表达 被引量：6

6

作者 张林 刘宝华 +1 位作者 童卫东 李春穴 《中华胃肠外科杂志》 CAS 2007年第2期119-123,共5页

目的研究绿色荧光蛋白（cFP）标记的人干细胞自血病基因（SCL）重组腺病毒载体的快速构建及在Cajal间质细胞（ICC）缺失模型鼠体内的分布和表达，为进一步研究慢传输型便秘（STC）的基因治疗奠定基础。方法利用Ad-Easy系统、细菌内同源... 目的研究绿色荧光蛋白（cFP）标记的人干细胞自血病基因（SCL）重组腺病毒载体的快速构建及在Cajal间质细胞（ICC）缺失模型鼠体内的分布和表达，为进一步研究慢传输型便秘（STC）的基因治疗奠定基础。方法利用Ad-Easy系统、细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒Ad-GFP／SCL。经尾静脉注射1．6×10^9PFU的重组腺病毒给ICC缺失模型Balb／c小鼠，在不同的时相点检测重组腺病毒在小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠及结直肠组织内的分布和表达；苏木精-伊红染色法观察重组腺病毒的体内毒性；RT-PCR法分析重组腺病毒介导的SCLmRNA在各脏器内的表达。结果通过荧光显微镜观察，在不同时期可以观察到小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠及结直肠组织内有不同程度的GFP表达：苏木精．伊红染色法显示各脏器未见明显毒性反应；RT-PCR法分析显示各脏器均有不同程度的SCLmRNA表达。结论成功构建的重组腺病毒Ad-GFP／SCL可介导SCL基因在ICC缺失模型Balb／c小鼠体内安全、稳定地表达，为进一步在体研究STC的基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 便秘 慢传输型 腺病毒载体 基因 干细胞白血病 基因疗法 同源重组 CAJAL间质细胞

原文传递

根癌农杆菌介导的定点敲除技术在红色红曲菌中的应用 被引量：6

7

作者 邵彦春 李利 +3 位作者 杨莎 赵颖 王小红 陈福生 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期231-237,共7页

红曲菌(Monascus spp.)是一种重要的丝状真菌,广泛应用于食品和医药领域中。目前,由于对红曲菌遗传背景了解的很少,因而对其重要功能基因的研究报道很少。本研究采用根癌农杆菌介导的转化技术对红色红曲菌(Monascus ruber)中推断的G-蛋... 红曲菌(Monascus spp.)是一种重要的丝状真菌,广泛应用于食品和医药领域中。目前,由于对红曲菌遗传背景了解的很少,因而对其重要功能基因的研究报道很少。本研究采用根癌农杆菌介导的转化技术对红色红曲菌(Monascus ruber)中推断的G-蛋白信号调节子mrfA基因的RGS功能域进行定点缺失研究,探讨基于同源重组为基础的基因定点缺失技术在红曲菌基因功能鉴定中的可行性。构建的敲除载体pC805S左右同源臂长度分别为958bp和824bp,将其转入受体菌M.ruber中,得到的138株转化子中,有26株转化子发生了同源重组,重组率达到18.8%。实验结果表明该技术作为红曲菌基因功能鉴定的方法是可行的。 展开更多

关键词 红色红曲菌 mrfA基因 同源重组 定点缺失

原文传递

表达猪瘟病毒石门株E2抗原的重组腺病毒构建及免疫性研究 被引量：5

8

作者 孙永科 杨玉艾 +1 位作者 王养会 张彦明 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期137-142,共6页

应用PCR从pMD18-T-E2质粒中扩增编码猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带CSFVE2基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E2,转染... 应用PCR从pMD18-T-E2质粒中扩增编码猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带CSFVE2基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E2,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E2,PCR证实E2基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒转染293细胞中E2蛋白的表达。ELISA检测结果表明,pAd-E2能刺激小鼠产生高效价的抗体,也能刺激猪体产生抗体。将pAd-E2通过肌肉和皮下接种途径免疫商品化猪2次,21d后用1000倍TCID50CSFV强毒攻击。pAd-E2免疫组有1/4头死亡,而非重组腺病毒pAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡。该研究为研制猪瘟基因工程疫苗提供了有用的数据。 展开更多

关键词 腺病毒 猪瘟病毒 E2基因 同源重组 保护效果

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细菌内同源重组高效制备人突变p27基因重组腺病毒 被引量：4

9

作者 陈珺 徐少勇 +2 位作者 邓长生 王家宁 黄永章 《第四军医大学学报》 北大核心 2004年第5期406-409,共4页

目的 :利用细菌内同源重组法 ,构建含人突变p2 7(hp2 7mt)基因重组腺病毒 .方法 :hp2 7mt自载体 pORF9 hp2 7mt中切出 ,亚克隆至穿梭质粒 pShuttle CMV中 ,形成转移质粒pShuttle CMV hp2 7mt;然后再用PmeI线性化的pShuttle CMV hp2 7mt... 目的 :利用细菌内同源重组法 ,构建含人突变p2 7(hp2 7mt)基因重组腺病毒 .方法 :hp2 7mt自载体 pORF9 hp2 7mt中切出 ,亚克隆至穿梭质粒 pShuttle CMV中 ,形成转移质粒pShuttle CMV hp2 7mt;然后再用PmeI线性化的pShuttle CMV hp2 7mt转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy 1的超感受态BJ5 1 83,使其在细菌内发生同源重组 .重组质粒鉴定正确后经PacI酶切 ,转入Ad2 93细胞 ,包装成重组腺病毒Ad hp2 7mt.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定 ,用紫外分光光度计进行滴度测定 .结果 :用含pShuttle CMV hp2 7mt转化含pAdeasy 1的超感受态BJ5 1 83后 ,可获得约 30 %的阳性重组质粒 .PCR检测表明重组腺病毒含有目的基因 .滴度为 7.95× 1 0 1 5pfu/L .结论 :用细菌内同源重组法可快速、高效制备均一的高滴度重组腺病毒 .为研究 p2 展开更多

关键词 同源重组 细菌 重组腺病毒 p27mt基因

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表达猪瘟病毒石门株E0抗原的重组腺病毒构建及免疫性的研究 被引量：4

10

作者 孙永科 杨玉艾 +1 位作者 王养会 张彦明 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期482-487,共6页

应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装... 应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E0,PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中,用Western blot检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒免疫小鼠和猪,结果2次免疫后产生明显的免疫应答,ELISA检测小鼠血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10240;猪血清抗体滴度分别为1∶16和1∶64。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒,该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度,免疫猪后能提供一定的保护效果。 展开更多

关键词 腺病毒 猪瘟病毒 E0基因 同源重组

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人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定 被引量：4

11

作者 蒋春华 高钰琪 +3 位作者 黄庆愿 黄缄 贺伟峰 段小军 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第20期2040-2043,共4页

目的构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况。方法采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK... 目的构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况。方法采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HepG2细胞感染效率的监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明重组腺病毒载体成功,人HIF-1α重组腺病毒滴度达1.15×1010pfu/ml,阴性对照腺病毒的滴度为8×1010pfu/ml,并对HepG2细胞具有很强的感染力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含人HIF-1α基因的重组腺病毒载体。 展开更多

关键词 腺病毒 HIF-1Α基因 同源重组

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表达丙型肝炎病毒NS3抗原的重组腺病毒构建及体外表达 被引量：3

12

作者 李卫华 赵连三 +3 位作者 周陶友 何芳 刘丽 刘聪 《中国病毒学》 CAS CSCD 2005年第2期101-104,共4页

为探索研制丙型肝炎疫苗的新途径,以期获得防治丙型肝炎的重组腺病毒减毒活疫苗,我们构建了表达丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus ,HCV)非结构蛋白3(non structural protein 3,NS3)抗原的重组腺病毒RAd NS3,并检测其在体外表达。应用PCR... 为探索研制丙型肝炎疫苗的新途径,以期获得防治丙型肝炎的重组腺病毒减毒活疫苗,我们构建了表达丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus ,HCV)非结构蛋白3(non structural protein 3,NS3)抗原的重组腺病毒RAd NS3,并检测其在体外表达。应用PCR从真核表达质粒pRC/NS3 中扩增编码HCV NS3 蛋白(329-935aa)的基因片段,定向克隆到重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带HCV NS3基因的重组腺病毒基因组质粒pAd HCV NS3,转染293 细胞,成功包装出重组腺病毒RAd NS3,利用它有效地感染人肝癌细胞株HepG2,经RT PCR及免疫印迹等不同方法检测表明,被感染细胞能表达HCVNS3蛋白,为后续进行重组腺病毒在动物体内诱导抗HCV免疫应答能力的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 腺病毒 丙型肝炎病毒 NS3 同源重组 表达

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人脂联素基因重组腺病毒的构建与鉴定 被引量：2

13

作者 李丙蓉 郑宏庭 +4 位作者 邓华聪 郑丹 刘金波 兰丽珍 程伟 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期1676-1680,共5页

目的:构建含有人脂联素基因apM1的重组腺病毒载体,制备能表达人脂联素蛋白的重组腺病毒,为脂联素用于体内外干预动脉粥样硬化奠定基础。方法:自质粒pGEM-T-apM1上扩增两端带有SalⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的全长apM1基因,将PCR产物和穿梭质粒... 目的:构建含有人脂联素基因apM1的重组腺病毒载体,制备能表达人脂联素蛋白的重组腺病毒,为脂联素用于体内外干预动脉粥样硬化奠定基础。方法:自质粒pGEM-T-apM1上扩增两端带有SalⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的全长apM1基因,将PCR产物和穿梭质粒pShuttle-CMV经SalⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,连接、转化、筛选,进行PCR鉴定后送双向测序。将鉴定正确的重组质粒pShuttle-CMV-apM1用PmeⅠ酶切使其线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转BJ5183菌,进行细菌内同源重组,筛选、鉴定、扩增,PacⅠ酶切后用LipofectamineTM2000转染低代数的HEK293包装细胞,进行包装出毒。结果:重组穿梭质粒pShuttle-CMV-apM1经PCR和测序鉴定正确,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,转染293细胞进行包装,产生的病毒经鉴定正确,并且无具有复制能力的腺病毒存在,生物安全性高。结论:成功的制备了apM1基因重组腺病毒,可进一步用于脂联素干预动脉粥样硬化的研究。 展开更多

关键词 apM1基因 腺病毒 同源重组

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鼠A20基因的腺病毒载体构建及耳蜗毛细胞表达 被引量：2

14

作者 袁伟 张学渊 +2 位作者 侯春丽 魏勇 朱楚洪 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期337-339,345,共4页

目的构建鼠锌指蛋白A20基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠耳蜗毛细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经亚克隆后将A20基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染HEK293细胞包装、扩增... 目的构建鼠锌指蛋白A20基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠耳蜗毛细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经亚克隆后将A20基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染HEK293细胞包装、扩增,将重组腺病毒感染耳蜗毛细胞。PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因对病毒滴度和感染情况进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果表明A20基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5×109pfu/mL,并对耳蜗毛细胞有很强的感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含鼠A20基因的重组腺病毒载体。 展开更多

关键词 腺病毒 A20基因 同源重组

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人AQP1基因的重组腺病毒构建及鉴定 被引量：1

15

作者 杨彦春 杨军 +2 位作者 周继祥 李慧增 肖林 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期530-532,共3页

目的　构建人AQP1(hAQP1)基因的重组腺病毒载体。方法　采用DNA重组与细菌内同源重组技术 ,构建含hAQP1的复制缺陷型重组腺病毒载体 (pAdEasy 1 hAQP1) ,并观察pAdEasy 1 hAQP1在ECV 3 0 4中的感染情况。PCR方法鉴定重组腺病毒载体 ,利... 目的　构建人AQP1(hAQP1)基因的重组腺病毒载体。方法　采用DNA重组与细菌内同源重组技术 ,构建含hAQP1的复制缺陷型重组腺病毒载体 (pAdEasy 1 hAQP1) ,并观察pAdEasy 1 hAQP1在ECV 3 0 4中的感染情况。PCR方法鉴定重组腺病毒载体 ,利用绿色荧光蛋白GFP检测病毒滴度和感染效率。结果　PCR及限制性内切酶酶切鉴定证明pAdEasy 1 hAQP1构建成功。 展开更多

关键词 腺病毒 AQP1 同源重组

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携带Hath1和红色荧光蛋白DsRed2基因的重组腺病毒的构建和鉴定 被引量：1

16

作者 陈杰 高下 +1 位作者 徐琳 麻晓峰 《中国耳鼻咽喉颅底外科杂志》 CAS 2008年第6期407-411,共5页

目的构建带有人Hath1基因和红色荧光蛋白DsRed2基因的重组腺病毒载体。方法利用腺病毒细菌内同源重组方法,构建带有目的基因Hath1及红色荧光蛋白基因DsRed2的复制缺陷型重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1,通过酶切及测序验证重组腺病毒的DNA,... 目的构建带有人Hath1基因和红色荧光蛋白DsRed2基因的重组腺病毒载体。方法利用腺病毒细菌内同源重组方法,构建带有目的基因Hath1及红色荧光蛋白基因DsRed2的复制缺陷型重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1,通过酶切及测序验证重组腺病毒的DNA,利用荧光显微镜观察重组腺病毒在HEK293细胞中的包装情况,通过WesternBlot方法检测Hath1蛋白的表达情况,用空斑测定法进行病毒滴度测定。结果构建的重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1酶切电泳及测序鉴定正确,重组腺病毒包装成功,荧光显微镜下可见红色荧光蛋白成功表达,WesternBlot方法检测到目的蛋白Hath1成功表达,并得到滴度达6.0×1010pfu/ml的病毒溶液。结论应用细菌内同源重组的方法成功构建了含Hath1基因和红色荧光蛋白DsRed2基因的重组腺病毒载体。 展开更多

关键词 Hath 1 腺病毒 同源重组 表达

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人骨保护素基因重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：1

17

作者 王晓军 王爱民 +6 位作者 张忠荣 吴思宇 郭庆山 吴军 贺伟峰 汤守营 张全顺 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 2005年第2期167-170,共4页

目的构建人骨保护素(hOPG)基因的重组腺病毒载体并检测其转染能力。方法采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携... 目的构建人骨保护素(hOPG)基因的重组腺病毒载体并检测其转染能力。方法采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带hOPG基因的重组腺病毒AdEasy-PAdtrack-CMV-hOPG,将重组腺病毒AdhOPG对大鼠骨髓基质细胞(rMSCs) 进行感染。采用PCR方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度。结果酶切鉴定及PCR结果证明hOPG基因重组腺病毒载体成功, 病毒滴度可达2．5×108pfu／ml,具有很强感染能力,结论应用细菌内同源重组法,成功构建了含 hOPG重组腺病毒载体。 展开更多

关键词 人骨保护素 基因重组腺病毒载体 adEasy系统 大鼠骨髓基质细胞 细菌内同源重组法 基因工程技术 293细胞 PCR方法 载体质粒 基因片段 大肠杆菌 骨架质粒 基因转染 酶切鉴定 病毒滴度 感染能力 G基因 hOP 计数法 检测 荧光

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人p16基因的重组腺病毒构建及鉴定

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作者 田文标 陈丽芬 邹全明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第22期2213-2215,共3页

目的构建含有人p16基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定。方法用基因工程技术将人p16基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,然后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞,并在其中包... 目的构建含有人p16基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定。方法用基因工程技术将人p16基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,然后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞,并在其中包装扩增病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果酶切鉴定及PCR结果证明p16基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6.1×1010pfu/m l,对人成纤维细胞有较强感染能力。结论应用细菌内同源重组方法成功构建了含人p16基因的重组腺病毒载体。 展开更多

关键词 腺病毒 P16基因 同源重组

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蛋白激酶Nemo样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

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作者 程筱雯 梁俊波 +1 位作者 缪时英 王琳芳 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期632-637,I0014,共7页

目的构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体。方法采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、... 目的构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体。方法采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、转化、筛选、鉴定后,将Western blot检测表达正确的重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体再经酶切、电转入BJ5183感受态细胞(已包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)同源重组,并筛选、鉴定、扩增。通过PacI酶切后,以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚-氯仿-异戊醇法回收酶切产物,用高效低毒高稳定性的FuGENE HD转染试剂替代传统的lipofectamin 2000转染低代数的HEK293A包装细胞,进行病毒包装。包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞HCT116,Western blot检测以确认NLK及其突变体蛋白的表达。结果经PCR、测序及Western blot检测证实,成功构建了携带NLK基因及其突变体的腺病毒载体,PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液,扩增后感染结直肠癌细胞HCT116能正确表达NLK蛋白及其突变体蛋白。结论成功制备NLK基因及其突变体重组腺病毒,可进一步用于NLK生理功能的研究。 展开更多

关键词 蛋白激酶Nemo样激酶 重组腺病毒载体 同源重组

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产诺加霉素链霉菌中失活snogA基因的研究

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作者 李梦茜 刘伟 +3 位作者 石煊雯 李继安 陈代杰 邵雷 《工业微生物》 CAS CSCD 2014年第2期42-45,共4页

诺加霉素是重要的蒽环类抗肿瘤抗生素,由黑胡桃链霉菌ATCC27451发酵产生。本研究从诺加霉素产生茵中克隆得到560 bp的氨基甲基化酶(snogA)编码基因片段,并将其插入基因整合型质粒pKC1139的多克隆位点,构建得到基因中断质粒pLMX-3-58。... 诺加霉素是重要的蒽环类抗肿瘤抗生素,由黑胡桃链霉菌ATCC27451发酵产生。本研究从诺加霉素产生茵中克隆得到560 bp的氨基甲基化酶(snogA)编码基因片段,并将其插入基因整合型质粒pKC1139的多克隆位点,构建得到基因中断质粒pLMX-3-58。通过接合转移和同源重组,构建得到氨基甲基化酶编码基因被中断的重组菌株mLMX-3-59。基因重组突变株基因型验证结果表明,中断质粒以正确方式整合入基因组,将氨基甲基化酶编码基因中断。发酵验证结果表明,重组菌株发酵产物中不含有诺加霉素。本研究表明sngA基因在诺加霉素生物合成途径中是必需的。这为进一步阐明诺加霉素生物合成途径和组合生物合成改造诺加霉素提供了参考。 展开更多

关键词 诺加霉素 黑胡桃链霉菌 氨基甲基化酶 同源重组 基因失活

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