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脂质体介导mIL-12基因与MHCⅠ基因联合对小鼠实验性肝癌的治疗作用 被引量：9
1
作者 王克敏 夏爱娣 陈诗书 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第10期1041-1046,共6页
背景与目的:白细胞介素-12及MHCⅠ基因均已单独用于肿瘤基因治疗。为探索两者的抗肿瘤协同效应,本研究探讨小鼠白细胞介素-12(mIL-12)基因与同种异型的MHCⅠ(小鼠为H-2K)基因联合治疗Balb/C小鼠实验性肝癌。方法:分别应用含mIL-12基因、... 背景与目的:白细胞介素-12及MHCⅠ基因均已单独用于肿瘤基因治疗。为探索两者的抗肿瘤协同效应,本研究探讨小鼠白细胞介素-12(mIL-12)基因与同种异型的MHCⅠ(小鼠为H-2K)基因联合治疗Balb/C小鼠实验性肝癌。方法:分别应用含mIL-12基因、C57BL/6小鼠H-2KbcDNA及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达质粒载体pcDNA3,体外经新型脂质体LipofectAMINE2000(LF2000)介导转染小鼠肝癌细胞株MM45T.Li,检测转染细胞外源基因的表达。将经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,注射于小鼠皮下,观察致瘤性的变化。在荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射上述脂质体-DNA复合物,观察瘤体生长情况及小鼠生存期的改变。结果:LF2000介导pcDNA3/GFP转染MM45T.Li细胞的最佳条件为脂质体与DNA为3∶1(μg∶μg),转染效率达30%。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,RT-PCR检测有mIL-12和H-2KbcDNA的特异扩增片段,WesternBlot检测显示有57kDaH-2Kb蛋白表达,ELISA检测mIL-12分泌量达48ng/ml/106细胞。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,其致瘤性下降;荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射该脂质体-DNA复合物,FACS检测显示小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD4+和CD8+的数量治疗组较对照组高,? 展开更多
关键词 白细胞介素-12 ^h-2k^b 脂质体 肝肿瘤 基因治疗 实验研究
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H-2K^b-BSP融合基因在大肠杆菌中的表达与纯化 被引量：5
2
作者 钱丽 钱书兵 钱关祥 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期30-32,共3页
目的 构建可生物素化Ｈ－２Ｋ～ｂ－ ＢＳＰ融合基因的表达载体。方法 采用 ＰＣＲ技术，从 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋） Ｋ～ｂ中扩增出Ｈ－２Ｋ～ｂ基因的胞外区，拼接上依赖 ＢｉｒＡ酶的可生物素化序列后，克隆人ｐＥＴ－４２ｂ... 目的 构建可生物素化Ｈ－２Ｋ～ｂ－ ＢＳＰ融合基因的表达载体。方法 采用 ＰＣＲ技术，从 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋） Ｋ～ｂ中扩增出Ｈ－２Ｋ～ｂ基因的胞外区，拼接上依赖 ＢｉｒＡ酶的可生物素化序列后，克隆人ｐＥＴ－４２ｂ（＋）高效表达载体进行诱导表达。并对表达产物进行纯化与复性。结果 成功地构建了融合表达载体ｐＥＴ－Ｈ－２Ｋ～ｂ－ＢＳＰ，对表达产物进行纯化与复性，并应用仅识别完整构象的抗Ｋ～ｂ分子的单克隆抗体对复性后产物进行了检测。证明表达产物已部分恢复了构象。结论 获得Ｈ－２Ｋ～ｂ－ ＢＳＰ融合蛋白的高效表达，为研究在原核系统中表达、纯化与复性，以及进一步利用亲和素在体外构建ＭＨＣ－Ｉ类分子四聚体，探讨免疫识别机制奠定了基础。 展开更多
关键词 ^h-2k^b 基因表达 纯化 复性
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绿色荧光蛋白与H-2K^b融合基因的构建及表达 被引量：5
3
作者 钱书兵 陈诗书 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期253-257,共5页
目的　构建GFP与H 2Kb 融合基因 ,并分析融合基因在活细胞中的表达。方法　应用基因工程技术构建H 2Kb 与绿色荧光蛋白 (GFP)的融合基因。RT PCR和Western印迹分析基因表达 ;激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局。结果　RT PCR和W... 目的　构建GFP与H 2Kb 融合基因 ,并分析融合基因在活细胞中的表达。方法　应用基因工程技术构建H 2Kb 与绿色荧光蛋白 (GFP)的融合基因。RT PCR和Western印迹分析基因表达 ;激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局。结果　RT PCR和Western印迹分析表明融合基因获得了正确表达。激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明 ,Kb GFP融合分子象天然Kb 分子一样表达在细胞膜表面 ,且胞外区域可被Kb 分子特异性单克隆抗体所识别 ,表明Kb GFP融合分子可在细胞内正确折叠和装配。Kb GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果。结论　Kb GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性 ,且不影响Kb 分子在细胞内的正确表达。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 ^h-2k^b融合基因 MhC 编码
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小鼠肝素酶H-2K^b限制性CTL表位预测及其MHC-I亲和力分析 被引量：6
4
作者 汤旭东 万瑛 +5 位作者 陈婷 熊震 陈陵 余松涛 罗元辉 杨仕明 《重庆医学》 CAS CSCD 2007年第9期820-822,共3页
目的预测肿瘤转移相关基因肝素酶的CTL表位,为探索基于肝素酶的抗原表位的免疫治疗奠定基础。方法利用基于超基序、量化基序结合人工神经网络方案开发的H-2Kb限制性CTL表位预测软件,对小鼠肝素酶蛋白的CTL表位进行预测,然后人工合成相... 目的预测肿瘤转移相关基因肝素酶的CTL表位,为探索基于肝素酶的抗原表位的免疫治疗奠定基础。方法利用基于超基序、量化基序结合人工神经网络方案开发的H-2Kb限制性CTL表位预测软件,对小鼠肝素酶蛋白的CTL表位进行预测,然后人工合成相关待测表位肽,再对这些合成肽与MHC-I结合亲和力进行检测。结果采用机算机网络系统,预测了5条小鼠肝素酶抗原表位,即mHpa234~241(LGEDFVEL),mHpa351~358(FAAGFMWL),mHpa519~526(FSYGFFVI),mHpa386~393(VDENFEPL),mHpa398~405(LSLLFKKL),MHC亲合力实验表明,与阴性对照肽对比,随着预测肽浓度增加,H-2Kb的表达逐渐增加,与MHC-Ⅰ类分子的亲和力亦逐渐增强,当预测肽浓度达到30μmol/L时,其荧光系数(FI)均大于1.5。结论通过计算机软件预测到的5条小鼠肝素酶CTL表位与MHC-Ⅰ类分子均有较高的结合亲和力,为该表位的下一步体内鉴定及基于小鼠肝素酶抗原表位的肿瘤免疫治疗奠定基础。 展开更多
关键词 鼠肝素酶 CTL表位 ^h-2k^b限制性
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H-2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达 被引量：2
5
作者 钱书兵 钱关祥 陈诗书 《上海第二医科大学学报》 CSCD 1999年第3期193-196,200,共5页
目的克隆H－2KbcDNA及研究其在多种真核细胞中的表达。方法RT－PCR法扩增H－2KbcDNA，克隆入双顺反子逆转录病毒载体pGCEN，PA317包装出重组病毒后，分别感染NIH3T3、COS7及MM45T．Li，PCR和RT－PCR分析目的基因表达，FACS分析H－2Kb在... 目的克隆H－2KbcDNA及研究其在多种真核细胞中的表达。方法RT－PCR法扩增H－2KbcDNA，克隆入双顺反子逆转录病毒载体pGCEN，PA317包装出重组病毒后，分别感染NIH3T3、COS7及MM45T．Li，PCR和RT－PCR分析目的基因表达，FACS分析H－2Kb在细胞膜上的表达。结果以双顺反子逆转录病毒载体pGCEN介导，分别建立了H－2Kb基因转导细胞：NIH3T3／Kb、COS7／Kb及MM45T．Li／Kb。PCR结果表明目的基因已存在于宿主细胞中，RT－PCR结果表明目的基因已获得正确表达。FACS结果表明H－2Kb分子已稳定表达在细胞膜表面。结论MHC分子基因在多种真核细胞中的表达为研究抗原递呈及抗肿瘤作用提供了基础。 展开更多
关键词 ^h-2k^b基因 克隆 逆转录病毒载体 真核表达 CDNA
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H-2K^b限制性WT1蛋白CTL表位肽基因疫苗的构建与鉴定 被引量：1
6
作者 范艳 杨蓉 +2 位作者 樊卫平 陈武娟 申晓贺 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期404-407,共4页
目的构建H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位肽的真核表达载体并检测其在293T细胞中的表达,并鉴定疫苗抗肿瘤效应。方法筛选鉴定H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位9肽,设计并合成肽疫苗核酸序列,插入p UC57载体,经酶切和测序鉴定,亚克隆至真核表达载体p... 目的构建H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位肽的真核表达载体并检测其在293T细胞中的表达,并鉴定疫苗抗肿瘤效应。方法筛选鉴定H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位9肽,设计并合成肽疫苗核酸序列,插入p UC57载体,经酶切和测序鉴定,亚克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)及p EGFP-N1载体,转染293T细胞,RT-PCR鉴定目的基因的转录,共聚焦显微镜鉴定目的基因的表达。构建pc DNA3.1(+)-WT1免疫小鼠,取小鼠脾细胞进行体外特异CTL杀伤FBL3细胞试验。结果构建的基因疫苗经测序、双酶切及PCR鉴定确认无误;其携带的目的基因可在293T细胞中表达。免疫小鼠后特异CTL对FBL3杀伤结果高于对照组(P<0.05)。结论成功构建了H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位肽基因疫苗,载体疫苗能在真核细胞中成功表达,疫苗特异CTL具有体外杀伤肿瘤细胞功能,为提高WT1肽疫苗的抗肿瘤效应提供了新思路。 展开更多
关键词 h-2kb限制性 WT1蛋白 CTL 肽表位 基因疫苗
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小鼠H-2K^b基因转染人肝癌细胞后激活免疫排斥反应的研究
7
作者 张智翔 袁受力 +2 位作者 王小宁 张力 周殿元 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2000年第2期131-134,共4页
目的：增强人肝癌细胞的免疫原性以激活宿主免疫细胞识别杀伤相应的肝癌细胞。方法：以脂质体介导小鼠Ｈ－２Ｋｂ基因转染肝癌细胞株，并检测Ｈ－２Ｋｂ抗原表达情况，然后用Ｈ－２Ｋｂ基因转染后的肝癌细胞体外激活效应细胞杀伤活性，... 目的：增强人肝癌细胞的免疫原性以激活宿主免疫细胞识别杀伤相应的肝癌细胞。方法：以脂质体介导小鼠Ｈ－２Ｋｂ基因转染肝癌细胞株，并检测Ｈ－２Ｋｂ抗原表达情况，然后用Ｈ－２Ｋｂ基因转染后的肝癌细胞体外激活效应细胞杀伤活性，再进行裸鼠动物实验。结果：Ｈ－２Ｋｂ基因转染人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２后，Ｓｏｕｔｈｅｍ印迹杂交结果显示，Ｈ－２Ｋｂ基因整合于肿瘤细胞染色体中，ＲＮＡ点杂交结果显示，Ｈ－２ＫｂＤＮＡ已转录成ｍＲＮＡ。免疫组化及流式细胞仪检测显示，Ｈ－２Ｋｂ抗原已在肝癌细胞胞膜上表达。转染后肝癌细胞在体外能强烈诱发效应细胞毒性，这种细胞毒性现象在裸鼠实验中得到进一步验证。结论：异源ＭＨＧ－Ｉ类基因Ｈ－２Ｋｂ转染肝癌细胞后可增强其免疫原性并激活免疫效应细胞杀伤活性。 展开更多
关键词 ^h-2k^b基因 免疫原性 基因转染 肝肿瘤
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H-2K^b-OVA复合物的构建及体内特异性CTL的诱导
8
作者 钱丽 李锋 钱关祥 《上海免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2003年第3期158-163,共6页
在扩增了H 2Kb 基因后 ,将可生物素化的序列连接到其胞外区末端 ,构建成可溶性重组分子 ,进行原核表达。通过定点突变获得了高表达的融合蛋白 ,再利用 6×Histidinetag进行蛋白纯化 ,在对H 2Kb分子高亲和力的OVA2 57 2 64肽及 β2 ... 在扩增了H 2Kb 基因后 ,将可生物素化的序列连接到其胞外区末端 ,构建成可溶性重组分子 ,进行原核表达。通过定点突变获得了高表达的融合蛋白 ,再利用 6×Histidinetag进行蛋白纯化 ,在对H 2Kb分子高亲和力的OVA2 57 2 64肽及 β2 m蛋白存在下 ,三者体外折叠成具有完整构象的H 2Kb OVA类分子复合物。用其作为免疫原诱导特异性CTL ,并构建H 2Kb OVA四聚体检测特异性CTL。应用H 2Kb OVA四聚体对特异性CTL检测结果与经典的细胞毒试验一致 ,同时对胞外IFN γ进行了检测。说明H 2Kb OVA复合物可有效诱导体内特异性CTL反应 ,在体外构建MHC I类分子四聚体 。 展开更多
关键词 四聚体 ^h-2k^b-OVA复合物 表达 纯化 特异性CTL
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