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鸭源鸡杆菌毒素蛋白GtxA表达和间接ELISA方法的建立及初步应用 被引量：3
1
作者 李欢 杨霞 +7 位作者 赵军 魏亚鹏 陈陆 王新卫 常洪涛 李永涛 刘红英 王川庆 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期50-56,共7页
扩增鸡杆菌毒力基因gtxA全长序列,对GtxA蛋白的抗原性进行预测。将gtxA基因的部分抗原表位区所处片段克隆至pGEX-6P-1载体,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内表达。重组菌在37℃条件下经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明该蛋白高效表达,表达蛋白... 扩增鸡杆菌毒力基因gtxA全长序列,对GtxA蛋白的抗原性进行预测。将gtxA基因的部分抗原表位区所处片段克隆至pGEX-6P-1载体,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内表达。重组菌在37℃条件下经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明该蛋白高效表达,表达蛋白相对分子质量约为50 000,以可溶性蛋白和包涵体蛋白2种形式存在。Western blotting分析表明,获得的蛋白具有良好的反应原性和特异性。以纯化的GtxA蛋白为包被抗原建立了抗GtxA间接ELISA方法:抗原最佳包被质量为0.403μg/孔,一抗血清的最佳稀释度为1∶160,酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2 000,阳性判定标准为血清D450≥0.28。应用建立的检测方法对680份临诊鸡血清进行检测,结果显示河南省不同地区鸡群鸡杆菌感染阳性率为19.06%(129/680)。结果表明,该方法可有效检测鸡杆菌血清抗体。 展开更多
关键词 鸡杆菌 gtxa 融合蛋白 间接ELISA 抗体监测
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鸭源鸡杆菌gtxA突变株构建及其生物特性分析 被引量：4
2
作者 王继洋 彭志锋 +5 位作者 刘盼盼 王坤芃 王川庆 陈陆 赵军 杨霞 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期414-420,共7页
为了了解毒素GtxA对鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)生物学特性及致病性的影响,利用自然转化和正向筛选法构建了1株G.anatis gtxA缺失突变株,初步探究突变株的生物学特性。与亲本菌株比较,突变株溶血活性消失,菌落形态及生... 为了了解毒素GtxA对鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)生物学特性及致病性的影响,利用自然转化和正向筛选法构建了1株G.anatis gtxA缺失突变株,初步探究突变株的生物学特性。与亲本菌株比较,突变株溶血活性消失,菌落形态及生长速率并未出现显著改变,其对小鼠的致病力下降。外毒素GtxA参与G.anatis致病过程并扮演一定角色;G.anatis gtxA基因突变株的构建及其生物学特性探究为更好的了解其致病机理和研发出更为高效安全疫苗建立了理论基础。 展开更多
关键词 G.anatis gtxa基因 突变株 致病性
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鸭源鸡杆菌gtxA/flfA基因双缺失株的构建及其生物学特性分析 被引量：2
3
作者 刘盼盼 王继洋 +8 位作者 杨霞 刘红英 李永涛 常洪涛 王新卫 夏银河 陈陆 赵军 王川庆 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1099-1105,共7页
为了解RTX样毒素Gtx A及F-17菌毛的flfA基因在鸭源鸡杆菌中的功能,本研究利用自然转化法对鸭源鸡杆菌RZΔgtxA进一步缺失flfA基因构建RZΔgtxAΔflfA菌株,通过分析其生长特性、生物被膜形成能力、黏附能力及对细胞毒性的变化,探究其与... 为了解RTX样毒素Gtx A及F-17菌毛的flfA基因在鸭源鸡杆菌中的功能,本研究利用自然转化法对鸭源鸡杆菌RZΔgtxA进一步缺失flfA基因构建RZΔgtxAΔflfA菌株,通过分析其生长特性、生物被膜形成能力、黏附能力及对细胞毒性的变化,探究其与鸭源鸡杆菌致病性可能的关系。结果显示,RZΔgtxAΔflfA能稳定遗传flfA基因的缺失;单双基因突变株溶血活性均消失,但二者菌落形态及生长速率并未出现显著改变;二者生物被膜形成能力均明显下降(p<0.001),但RZΔgtxAΔflfA相比RZΔgtxA生物被膜形成能力稍有增强但差异不显著;二者对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力及毒性均减弱(p<0.05),且RZΔgtxAΔflfA对细胞的黏附能力减弱更明显(p<0.01)。以上结果表明,GtxA毒素和F-17菌毛在鸭源鸡杆菌黏附及对鸡原代输卵管上皮细胞的毒力中起重要作用,且呈现明显的协同关系。本研究为鸭源鸡杆菌致病机理的探究奠定基础。 展开更多
关键词 鸭源鸡杆菌 RZΔgtxa RZΔgtxaΔflfA gtxa 菌毛
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鸭源鸡杆菌双重PCR检测方法的初步建立 被引量：2
4
作者 皇甫和平 杨霞 +6 位作者 赵军 王川庆 陈陆 常洪涛 王新卫 刘红英 姚慧霞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期640-643,共4页
为建立鸭源鸡杆菌(G.anatis)双重PCR检测方法,并对鸡杆菌分离株进行种类鉴定,本研究根据GenBank中G.anatis 12656-12株的gtxA基因序列设计一对PCR引物,合成扩增rpoB基因的引物作为内参基因,建立了G.anatis双重PCR检测方法。检测结果显示... 为建立鸭源鸡杆菌(G.anatis)双重PCR检测方法,并对鸡杆菌分离株进行种类鉴定,本研究根据GenBank中G.anatis 12656-12株的gtxA基因序列设计一对PCR引物,合成扩增rpoB基因的引物作为内参基因,建立了G.anatis双重PCR检测方法。检测结果显示:以G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG株DNA为模板进行的双重PCR检测能够扩增出两条目的片段;其它16株细菌包括副鸡禽杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、福氏志贺菌和奇异变形杆菌均只扩增出了一条目的片段;该方法可以检测到浓度为6.5×102cfu/mL的G.anatis;34株鸡杆菌分离株均扩增出了两条预期大小的目的片段。此外,序列分析结果表明,10株鸡杆菌河南分离株的rpoB基因序列与鸭源鸡杆菌种参考株(CCUG 15563)的同源性最高(97.5%～99.0%),属于鸭源鸡杆菌种。本研究建立的G.anatis双重PCR检测方法,可用于含gtxA基因鸡杆菌菌株的鉴定及临床病原学诊断。 展开更多
关键词 鸭源鸡杆菌 双重PCR gtxa基因 RPOB基因 同源性分析
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鸭源鸡杆菌ompW、gtxA双基因缺失株的构建及其相关特性分析
5
作者 夏银河 王坤芃 +7 位作者 刘盼盼 王新卫 常洪涛 彭志锋 刘红英 陈陆 杨霞 王川庆 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期2311-2322,共12页
鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)是家禽中常见的条件性致病菌,主要引起蛋鸡生殖道疾病,造成产蛋量下降。【目的】为探究RTX样毒素GtxA及外膜蛋白(OmpW)对鸭源鸡杆菌生物学特性和致病力的影响。【方法】本研究采用自然转化... 鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)是家禽中常见的条件性致病菌,主要引起蛋鸡生殖道疾病,造成产蛋量下降。【目的】为探究RTX样毒素GtxA及外膜蛋白(OmpW)对鸭源鸡杆菌生物学特性和致病力的影响。【方法】本研究采用自然转化法对突变株RZ△ompW进一步缺失gtxA构建突变株RZ△ompW△gtxA,通过分析其生长特性、黏附能力、引起细胞凋亡程度及对小鼠致病性等,探究其与生物学特性及致病性可能的关系。【结果】结果显示,RZ△ompW△gtxA能稳定遗传gtxA的缺失;单双基因突变株溶血活性均消失、与RZ株相比菌落形态及生长速率并未出现显著改变;相比RZ、RZ△ompW和RZ△gtxA,双基因缺失株RZ△ompW△gtxA在不同时段对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力显著降低(P<0.05),诱导鸡输卵管上皮原代细胞发生凋亡的能力明显减弱,对小鼠的致病力显著降低。【结论】GtxA毒素和外膜蛋白OmpW在鸭源鸡杆菌毒力、黏附宿主细胞及诱导其细胞凋亡中起重要作用,且可能存在明显的协同关系。本研究为鸭源鸡杆菌感染机制的阐明奠定基础。 展开更多
关键词 鸭源鸡杆菌 RZ△ompW△gtxa缺失株 生物学特性 致病性
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