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鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的原核表达和单克隆抗体制备 被引量：5
1
作者 侯湾湾 韩先干 +5 位作者 王少辉 王小兰 岳嘉蘋 曹守林 范红结 于圣青 《中国动物传染病学报》 CAS 2014年第2期58-64,共7页
本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛... 本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 鸭疫里默氏杆菌 groel蛋白 单克隆抗体
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乳鼠志贺杆菌分泌蛋白GroEL多克隆抗体的制备与鉴定
2
作者 刘梦琦 贾雪娇 +4 位作者 刘洋 刘长城 李小凤 胡屹硕 赵微 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2024年第2期137-143,共7页
目的制备志贺杆菌分泌蛋白GroEL多克隆抗体,为探究乳鼠志贺杆菌上清蛋白GroEL在乳鼠肠道内的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术构建原核表达蛋白质粒Pet28a(+)-GroEL,转化Escherichia coil BL21(DE3)后采用不同浓度IPTG诱导表达,优化... 目的制备志贺杆菌分泌蛋白GroEL多克隆抗体,为探究乳鼠志贺杆菌上清蛋白GroEL在乳鼠肠道内的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术构建原核表达蛋白质粒Pet28a(+)-GroEL,转化Escherichia coil BL21(DE3)后采用不同浓度IPTG诱导表达,优化诱导时间和温度,确定最佳蛋白表达条件;利用His标签亲和层析法纯化GroEL蛋白。将纯化蛋白与佐剂按照等比例充分混合后免疫C57BL/6小鼠,制备多克隆抗体血清,采用ELISA检测血清抗体的效价、灵敏度及特异性。构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-GroEL并转染293T细胞,48 h后采用制备的GroEL多克隆抗体进行Western blot验证。结果Pet28a(+)-GroEL转化E.coil BL21(DE3)菌在28℃、0.4 mmol/L IPTG诱导12h获得最佳蛋白表达,表达的重组蛋白分子质量约为63 ku,纯化后的蛋白浓度为0.735 mg/mL。Western blot检测显示该蛋白能被抗His标签鼠单克隆抗体识别。ELISA检测显示制备的抗GroEL多克隆抗体血清效价为1∶128000;Western blot检测显示该抗体可识别GroEL蛋白。结论重组表达的GroEL蛋白具有抗原性,制备的鼠抗GroEL多克隆抗体血清具有特异性且效价高,为研究乳鼠志贺杆菌GroEL蛋白与肠道病毒之间的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 志贺菌 groel蛋白 蛋白纯化 多克隆抗体制备 轮状病毒
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生殖支原体GroEL蛋白的生物信息学分析、表达纯化及致炎分析
3
作者 陈丽 苏晓玲 +5 位作者 罗浩荡 王婧芸 廖道庸 甘甜 于建威 何军 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期4084-4097,共14页
为了解生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)GroEL蛋白的致病机制,本研究运用生物信息学软件对MgGroEL蛋白结构和功能进行预测和分析,构建pET-28a-GroEL重组质粒,使用0.2 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,通过Ni-亚氨基二乙酸(iminodicitic ac... 为了解生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)GroEL蛋白的致病机制,本研究运用生物信息学软件对MgGroEL蛋白结构和功能进行预测和分析,构建pET-28a-GroEL重组质粒,使用0.2 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,通过Ni-亚氨基二乙酸(iminodicitic acid,IDA)柱亲和纯化获得Mg rGroEL蛋白。将浓度为2μg/mL的Mg rGroEL蛋白作用于人单核细胞白血病THP-1细胞,通过ELISA检测细胞上清液中炎症因子IL-1β和TNF-α的含量,使用全自动化学发光仪检测细胞上清液中炎症因子IL-6的含量,通过细胞免疫荧光和Western blotting观察NF-κB信号通路激活情况。结果表明,Mg GroEL蛋白是含有543个氨基酸的酸性带负电荷蛋白,相对分子质量为58.44 kDa,等电点为5.68,分子式为C_(2568)H_(4300)N_(700)O_(825)S_(8),为稳定的亲水性蛋白;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主;MgGroEL蛋白存在12个B细胞优势抗原表位和10个T细胞优势抗原表位。与肺炎支原体、无乳支原体、关节炎支原体、猪肺炎支原体和牛支原体的GroEL蛋白高度同源;Mg rGroEL蛋白能激活THP-1细胞NF-κB信号通路并促进IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。这些结果表明Mg GroEL具有较好的抗原性,能诱导宿主细胞发生炎症反应,本研究为进一步研究GroEL蛋白在Mg中的功能及其致病机制奠定了理论基础。 展开更多
关键词 生殖支原体 groel蛋白 原核表达 生物信息学 炎症
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鸡毒支原体GroEL蛋白通过NF-κB信号通路诱导DF-1细胞释放IL-1β的研究 被引量：2
4
作者 张琳 陈莹 +5 位作者 朱可蒙 赵雅芝 潘巧 郝文君 于颖 辛九庆 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期223-228,共6页
鸡毒支原体(MG)脂质相关膜蛋白(LAMPs)在刺激宿主细胞天然免疫中起重要作用,GroEL蛋白是本实验室前期利用质谱鉴定筛选出的LAMPS中的关键组分。为研究GroEL蛋白诱导宿主细胞炎性反应的信号通路,本研究通过原核表达系统表达出MG的GroEL蛋... 鸡毒支原体(MG)脂质相关膜蛋白(LAMPs)在刺激宿主细胞天然免疫中起重要作用,GroEL蛋白是本实验室前期利用质谱鉴定筛选出的LAMPS中的关键组分。为研究GroEL蛋白诱导宿主细胞炎性反应的信号通路,本研究通过原核表达系统表达出MG的GroEL蛋白,利用激光共聚焦试验、荧光定量PCR和western blot方法分别检测GroEL蛋白的粘附特性、p65入核、磷酸化水平及IL-1β分泌情况。激光共聚焦试验结果显示,GroEL蛋白能够黏附于DF-1细胞表面并刺激DF-1细胞中p65从胞浆转入细胞核;western blot检测显示GroEL蛋白能够激活NF-κB信号通路促进p65磷酸化水平提高;荧光定量PCR检测显示GroEL蛋白能够促进IL-1β释放,当NF-κB信号通路被抑制后,IL-1β的释放显著下降(p<0.01)。本研究结果表明MG GroEL蛋白能够粘附于宿主细胞表面并通过激活NF-κB信号通路诱导宿主细胞IL-1β的释放,从而在炎症反应中发挥作用。本研究为深入研究MG致病机制提供了实验依据。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 groel蛋白 IL-1Β P65 NF-ΚB
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幽门螺杆菌GroEL蛋白重组表达及表达产物小鼠免疫保护作用 被引量：2
5
作者 王艳芳 张慧 +3 位作者 王欢 孙萍萍 严杰 孙爱华 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期340-345,共6页
目的检测幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列差异，确定重组表达的GroEL蛋白（rGroEL）抗原性、免疫反应性以及对幽门螺杆菌感染小鼠的免疫保护性。方法采用PCR及测序法了解幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列。构建幽门螺杆菌groEL基因pET4... 目的检测幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列差异，确定重组表达的GroEL蛋白（rGroEL）抗原性、免疫反应性以及对幽门螺杆菌感染小鼠的免疫保护性。方法采用PCR及测序法了解幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列。构建幽门螺杆菌groEL基因pET42a-E．coli BL21DE3原核表达系统，采用SDS-PAGE及凝胶图像分析系统确定rGroEL表达量，Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL。采用ELISA和Western blot检测rGroEL的抗原性和免疫反应性，采用幽门螺杆菌全菌为包被抗原的ELISA确定GruEL膜定位。采用幽门螺杆菌小鼠感染模型了解rGroEL免疫保护作用。结果35株幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列相似性高达99．4％～100％。rGroEL表达量可达细菌总蛋白的56％，SDS—PAGE后提纯的rGmEL在凝胶中显示为单一的条带。rGroEL可诱导家兔和小鼠产生高效价IgG抗体，同时也能被幽门螺杆菌全菌抗体（Hp-IgG）或rGroEL-IgG识别并与之结合。GroEL是幽门螺杆菌表面蛋白抗原。50、100或200μg rGroEL免疫可分别使50．0％（6／12）、75．0％（9／12）和91．7％（11／12）小鼠免于幽门螺杆菌SS1株的感染，200μg rGroEL免疫保护率（91．7％）显著高于50μg rGroEL（50．0％）（P〈0．05）。结论幽门螺杆菌GroEL蛋白是序列保守、具有良好免疫原性和免疫保护性的表面抗原，可作为基因工程疫苗候选抗原。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 groel蛋白 重组表达 免疫保护作用
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不同寄主植物的烟粉虱(Bemisia tabaci)内共生菌传毒相关GroEL蛋白的一致性
6
作者 谭周进 谢丙炎 +3 位作者 杨宇红 郭建英 肖启明 万方浩 《生态学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期2490-2497,共8页
通过对7种寄主植物上B型烟粉虱北京种群的内共生菌传毒相关groEL基因进行PCR扩增和测序,结合已有的相关序列,构建了groEL基因及其编码的GroEL蛋白的分子系统树。结果表明:烟粉虱内共生菌产生的groEL基因是一个非常保守的基因,北京不同... 通过对7种寄主植物上B型烟粉虱北京种群的内共生菌传毒相关groEL基因进行PCR扩增和测序,结合已有的相关序列,构建了groEL基因及其编码的GroEL蛋白的分子系统树。结果表明:烟粉虱内共生菌产生的groEL基因是一个非常保守的基因,北京不同寄主植物的烟粉虱内共生菌与IsraelB型烟粉虱内共生菌的groEL基因亲源关系非常近,位于同一进化分支,其编码的GroEL蛋白的分子系统树也基本上是一致的。不同物种的groEL基因及其编码的GroEL蛋白分别位于不同的分支,说明groEL基因及其编码的GroEL蛋白的分子系统树可以用于分析物种间的进化关系。氨基酸序列比较表明:烟粉虱内共生菌GroEL具有原核GroEL的保守氨基酸、ATP酶活性位点、多肽结合位点和GroES连接位点,为典型的hsp60。不同来源烟粉虱内共生菌GroEL有少数几个保守氨基酸发生了置换,可能不是GroEL功能的重要位点。说明在容易变异的细菌基因组中,groEL基因为了维持其正常重要的生理功能,会通过保持功能位点的稳定性来应对不同生态因素的影响。 展开更多
关键词 内共生菌 烟粉虱 groel蛋白 生态功能 蛋白质一级结构
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钩端螺旋体groEL基因原核表达及其产物免疫保护作用 被引量：5
7
作者 李小余 王银环 +1 位作者 严杰 程东庆 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期164-170,共7页
目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株groEL基因原核重组表达系统,了解重组表达的GroEL蛋白(rGroEL)对金地鼠的免疫保护作用。方法:采用高保真PCR扩增问号钩体赖株groEL基因并测序,常规方法构建groEL基因原核表达系统... 目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株groEL基因原核重组表达系统,了解重组表达的GroEL蛋白(rGroEL)对金地鼠的免疫保护作用。方法:采用高保真PCR扩增问号钩体赖株groEL基因并测序,常规方法构建groEL基因原核表达系统。采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检查rGroEL表达情况及其可溶性,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL。观察rGroEL免疫金地鼠对问号钩体赖株感染的保护率。采用MAT法检测免疫动物血清与我国流行问号钩体血清群交叉凝集效价。结果:所克隆的groEL基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中相应基因完全相同。所构建的groEL基因原核表达系统能表达可溶性rGroEL。100和200μgrGroEL对金地鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%。rGroEL免疫金地鼠血清可不同程度地凝集各问号钩体血清群。结论:GroEL蛋白是问号钩体属特异性保护性抗原,可用于制备通用性钩体基因工程疫苗。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 groel蛋白质 遗传学 重组 遗传 基因表达 序列分析 DNA 免疫法 被动 groel基因 原核表达 免疫保护
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基于GroEL基因的实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立及评价 被引量：4
8
作者 谈忠鸣 李志峰 +6 位作者 吴斌 胡建利 祁贤 顾玲 鲍倡俊 汤奋扬 朱叶飞 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1121-1124,共4页
目的建立一种敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于检测临床标本中的恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体GroEL蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。并从灵敏度、特异度、重复性及临床标本的检测能力等方面对本... 目的建立一种敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于检测临床标本中的恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体GroEL蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。并从灵敏度、特异度、重复性及临床标本的检测能力等方面对本方法进行综合评价。结果建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性,可检测出恙虫病东方体Gilliam、Karp、Kato和Kawasaki株。建立的标准曲线循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈现良好的线性关系(r=0.99),灵敏度分析显示样品最低检出浓度为21.8拷贝/μL。批内及批间重复性实验变异系数均小于1.5%,显示本方法具有良好的重复性。对本实验室保存的82份临床标本进行检测,并与常规巢式PCR方法比较,本方法检测出26份阳性标本中的25份,检出率为96.15%。结论本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可用于临床病人及暴发疫情的实验室快速检测。 展开更多
关键词 恙虫病东方体 荧光定量PCR groel蛋白基因 临床标本
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结核分枝杆菌感染患者外周血热休克蛋白与诱导型一氧化氮合酶的相关性分析 被引量：4
9
作者 鄢仁晴 丁泉敏 闵迅 《中华医院感染学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第24期5563-5565,共3页
目的探讨结核分枝杆菌感染患者外周血和培养悬液中热休克蛋白(Groel1)与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的相关性。方法选取2015年6月-11月9例结核病潜伏感染患者与14例肺结核患者,取外周血培养巨噬细胞,采用ELISA法检测患者血清和巨噬细胞悬... 目的探讨结核分枝杆菌感染患者外周血和培养悬液中热休克蛋白(Groel1)与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的相关性。方法选取2015年6月-11月9例结核病潜伏感染患者与14例肺结核患者,取外周血培养巨噬细胞,采用ELISA法检测患者血清和巨噬细胞悬液中Groel1蛋白与iNOS的浓度。结果结核分枝杆菌潜伏感染患者与结核分枝杆菌感染患者外周血结核分枝杆菌Groel1蛋白与iNOS的浓度均呈正相关,相关系数为0.899,0.804;潜伏感染者与结核病患者血清与巨噬细胞培养悬液、iNOS和Groel1蛋白的浓度差异无统计学意义。结论 Groel1蛋白和iNOS可能参与巨噬细胞与结核分枝杆菌之间的相互作用,Groel1蛋白和iNOS外周血的表达水平不能作为结核感染患者的分期诊断指标。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 groel1蛋白 巨噬细胞 INOS
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结核分枝杆菌GroEL2蛋白表达、纯化及生物信息学分析
10
作者 宋亚敏 魏婧 +3 位作者 郭方正 李柏青 许涛 汪洪涛 《山西医科大学学报》 CAS 2023年第12期1591-1599,共9页
目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌H37Ra株GroEL2蛋白,并进行生物信息学分析。方法以结核分枝杆菌H37Ra株基因组DNA为模板,PCR扩增GroEL2基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组pET-28a-GroEL2载体,将其转化至BL21(DE3)菌株中,在异丙基硫代... 目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌H37Ra株GroEL2蛋白,并进行生物信息学分析。方法以结核分枝杆菌H37Ra株基因组DNA为模板,PCR扩增GroEL2基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组pET-28a-GroEL2载体,将其转化至BL21(DE3)菌株中,在异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达后,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳分析表达产物,镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱纯化重组GroEL2蛋白,Western blot鉴定GroEL2的表达效果。利用生物信息学方法对GroEL2蛋白的理化性质、蛋白结构、抗原表位等进行预测。结果成功构建重组pET-28a-GroEL2表达载体,在大肠杆菌中以可溶形式表达GroEL2蛋白。Ni-IDA亲和层析柱纯化重组GroEL2蛋白,纯度达90%以上。生物信息学分析显示其能与多种蛋白相互作用,且存在多个潜在的T细胞、B细胞抗原表位。结论重组GroEL2蛋白具有良好的免疫反应性,可能是结核病新型疫苗和诊断方法开发的新靶点。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 groel2蛋白 原核表达 蛋白纯化 生物信息学
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