为实现鸭星状病毒1型(Duck astrovirus type 1,DAstV-1)的快速检测,本试验针对DAstV-1(WF1202株)保守区域设计特异性引物,建立了基于染料SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR(qPCR)方法,利用所建方法对临床样本进行检测,并将其应用于阳性样...为实现鸭星状病毒1型(Duck astrovirus type 1,DAstV-1)的快速检测,本试验针对DAstV-1(WF1202株)保守区域设计特异性引物,建立了基于染料SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR(qPCR)方法,利用所建方法对临床样本进行检测,并将其应用于阳性样本病毒的分离和鉴定。结果表明所建qPCR检测方法的检测下限为4.64×10^(3)拷贝/μL,高于普通RT-PCR方法10倍;对禽类其他常见病原均为阴性,特异性良好;批内、批间变异系数(Cv)分别为0.85%~2.85%和0.21%~2.94%,均低于3.00%,表明其重复性良好。利用该方法对2020-2022年间10省份不同鸭场的35份组织病料进行检测,阳性率为25.71%(9/35),与普通RT-PCR检测结果的符合率为94.29%。任取1份阳性病料接种健康鸭胚进行病毒的分离,收集尿囊液利用所建qPCR方法进行检测,确定为阳性后接种1日龄健康雏鸭进行动物回归试验,感染雏鸭呈现一过性发病但未出现死亡,qPCR检测DAstV-1均为阳性,剖检可见肝脏有轻微出血,病理组织学观察发现肝细胞空泡变性,说明所分离的DAstV-1毒株致病性较弱。综上,本试验成功建立了DAstV-1的荧光定量PCR检测方法,可为DAstV-1的临床诊断、分离鉴定及分子流行病学监测等提供技术支撑。展开更多
为了建立一种可以快捷、灵敏、安全地检测D型流感病毒(Influenza D virus,IDV)的实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,RT-qPCR)方法,试验首先将IDV NP基因作为检测目标,根据其序列的保守区设计了一对RT-qPCR引物,然后采用单一...为了建立一种可以快捷、灵敏、安全地检测D型流感病毒(Influenza D virus,IDV)的实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,RT-qPCR)方法,试验首先将IDV NP基因作为检测目标,根据其序列的保守区设计了一对RT-qPCR引物,然后采用单一变量法对RT-qPCR反应条件中的引物浓度和退火温度进行优化,建立了一种可检测IDV的RT-qPCR方法,并对该方法的灵敏度、重复性和特异性进行检测,最后应用该方法进行临床样本检测。结果表明:所建立的RT-qPCR方法的最佳引物浓度和退火温度分别为400 nmol/L和61℃,标准曲线为y=-3.572x+42.02(R^(2)=0.9993);该方法能检测到的最低拷贝数为8.30×10^(1)copies,灵敏度是常规PCR的100倍左右;组内重复和组间重复变异系数(CV)值均小于3%;同时检测牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛疱疹病毒4型(BHV-4)和牛流行热病毒(BEFV)的结果均为阴性;应用该方法对收集到的244份有呼吸道症状的牛鼻拭子样品进行检测,阳性率为1.23%。说明成功建立了IDV RT-qPCR检测方法,该方法具有灵敏度高、重复性和特异性好的特点,为IDV的防控提供了可靠的技术支撑。展开更多
为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、...为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10^(3)拷贝/μL~1.0×10^(8)拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10^(2)拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%~4.41%和0.37%~0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。展开更多
目的:研究奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法。方法:针对坂崎肠杆菌16 s^23 s rDNA间区序列(ITS)设计一对SYBR G reenⅠ染料法引物、一对TaqM an探针法引物及探针,建立奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法,并对实时荧光PCR法、传统...目的:研究奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法。方法:针对坂崎肠杆菌16 s^23 s rDNA间区序列(ITS)设计一对SYBR G reenⅠ染料法引物、一对TaqM an探针法引物及探针,建立奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法,并对实时荧光PCR法、传统方法及PCR方法进行比较。结果:用10株坂崎肠杆菌,18株近源菌验证试验表明,本文所建立的两种实时荧光PCR方法特异性强;加菌试验表明,奶粉中坂崎肠杆菌有1.1 cfu/100 g时就可检出,灵敏度高;检验时间仅需2 d。结论:本文提出的奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法可在实际工作推广。展开更多
建立了一种以SYBR Green Ⅰ为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR方法.以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料,通过使用特异性引物和SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术,对转基因农作物中外源抗除草剂基...建立了一种以SYBR Green Ⅰ为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR方法.以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料,通过使用特异性引物和SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术,对转基因农作物中外源抗除草剂基因进行了定量检测,绘制了两种基因扩增的标准曲线图,根据标准曲线方程计算外源基因含量;并作了溶解曲线、检测方法检测灵敏度和精密度的分析.研究发现,两者标准曲线方程线性关系良好,R2值分别达到0.9939与0.9924.通过已知标准品进行验证,实测值与真值接近,与实际含量的相对偏差是6.52%和7.90%.结果表明,SYBR Green I结合染料法完全可以用于转基因农作物定量PCR检测.展开更多
文摘为实现鸭星状病毒1型(Duck astrovirus type 1,DAstV-1)的快速检测,本试验针对DAstV-1(WF1202株)保守区域设计特异性引物,建立了基于染料SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR(qPCR)方法,利用所建方法对临床样本进行检测,并将其应用于阳性样本病毒的分离和鉴定。结果表明所建qPCR检测方法的检测下限为4.64×10^(3)拷贝/μL,高于普通RT-PCR方法10倍;对禽类其他常见病原均为阴性,特异性良好;批内、批间变异系数(Cv)分别为0.85%~2.85%和0.21%~2.94%,均低于3.00%,表明其重复性良好。利用该方法对2020-2022年间10省份不同鸭场的35份组织病料进行检测,阳性率为25.71%(9/35),与普通RT-PCR检测结果的符合率为94.29%。任取1份阳性病料接种健康鸭胚进行病毒的分离,收集尿囊液利用所建qPCR方法进行检测,确定为阳性后接种1日龄健康雏鸭进行动物回归试验,感染雏鸭呈现一过性发病但未出现死亡,qPCR检测DAstV-1均为阳性,剖检可见肝脏有轻微出血,病理组织学观察发现肝细胞空泡变性,说明所分离的DAstV-1毒株致病性较弱。综上,本试验成功建立了DAstV-1的荧光定量PCR检测方法,可为DAstV-1的临床诊断、分离鉴定及分子流行病学监测等提供技术支撑。
文摘为了建立一种可以快捷、灵敏、安全地检测D型流感病毒(Influenza D virus,IDV)的实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,RT-qPCR)方法,试验首先将IDV NP基因作为检测目标,根据其序列的保守区设计了一对RT-qPCR引物,然后采用单一变量法对RT-qPCR反应条件中的引物浓度和退火温度进行优化,建立了一种可检测IDV的RT-qPCR方法,并对该方法的灵敏度、重复性和特异性进行检测,最后应用该方法进行临床样本检测。结果表明:所建立的RT-qPCR方法的最佳引物浓度和退火温度分别为400 nmol/L和61℃,标准曲线为y=-3.572x+42.02(R^(2)=0.9993);该方法能检测到的最低拷贝数为8.30×10^(1)copies,灵敏度是常规PCR的100倍左右;组内重复和组间重复变异系数(CV)值均小于3%;同时检测牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛疱疹病毒4型(BHV-4)和牛流行热病毒(BEFV)的结果均为阴性;应用该方法对收集到的244份有呼吸道症状的牛鼻拭子样品进行检测,阳性率为1.23%。说明成功建立了IDV RT-qPCR检测方法,该方法具有灵敏度高、重复性和特异性好的特点,为IDV的防控提供了可靠的技术支撑。
文摘为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10^(3)拷贝/μL~1.0×10^(8)拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10^(2)拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%~4.41%和0.37%~0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。
文摘目的:研究奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法。方法:针对坂崎肠杆菌16 s^23 s rDNA间区序列(ITS)设计一对SYBR G reenⅠ染料法引物、一对TaqM an探针法引物及探针,建立奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法,并对实时荧光PCR法、传统方法及PCR方法进行比较。结果:用10株坂崎肠杆菌,18株近源菌验证试验表明,本文所建立的两种实时荧光PCR方法特异性强;加菌试验表明,奶粉中坂崎肠杆菌有1.1 cfu/100 g时就可检出,灵敏度高;检验时间仅需2 d。结论:本文提出的奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法可在实际工作推广。
文摘建立了一种以SYBR Green Ⅰ为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR方法.以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料,通过使用特异性引物和SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术,对转基因农作物中外源抗除草剂基因进行了定量检测,绘制了两种基因扩增的标准曲线图,根据标准曲线方程计算外源基因含量;并作了溶解曲线、检测方法检测灵敏度和精密度的分析.研究发现,两者标准曲线方程线性关系良好,R2值分别达到0.9939与0.9924.通过已知标准品进行验证,实测值与真值接近,与实际含量的相对偏差是6.52%和7.90%.结果表明,SYBR Green I结合染料法完全可以用于转基因农作物定量PCR检测.
