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葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立 被引量：20
1
作者 范旭东 董雅凤 +2 位作者 张尊平 任芳 李亚惠 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期949-956,共8页
以复合感染4种病毒的‘红地球’(Red Globe)葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3(Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3)... 以复合感染4种病毒的‘红地球’(Red Globe)葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3(Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3)、沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV)、葡萄病毒B(Grapevine virusB,GVB)和葡萄病毒A(Grapevine virusA,GVA)的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。 展开更多
关键词 多重RT-PCR 检测 葡萄卷叶伴随病毒3 沙地葡萄茎痘病毒 葡萄病毒B 葡萄病毒A
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沙地葡萄茎痘相关病毒的RT-LAMP检测方法 被引量：9
2
作者 范旭东 董雅凤 +3 位作者 张尊平 任芳 胡国君 朱红娟 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期286-293,共8页
本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV)的RT-LAMP检测方法。以GRSPaV的RdRp基因序列(GenBank登录号:GQ478314)为靶序列,设计3组RT-LAMP引物,从中筛选出1组有效引物,并... 本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV)的RT-LAMP检测方法。以GRSPaV的RdRp基因序列(GenBank登录号:GQ478314)为靶序列,设计3组RT-LAMP引物,从中筛选出1组有效引物,并确定了适宜的反应温度和反应时间。对RT-LAMP产物进行HhaⅠ酶切,酶切片段与理论片段大小一致,证明了RT-LAMP产物的特异性。RT-LAMP方法能够检测出GRSPaV的RNA最大稀释倍数为10-4,与RT-PCR方法相比更为灵敏。田间葡萄样品RT-LAMP检测结果与已知样品带毒情况相同,表明RT-LAMP检测GRSPaV具有较好的可靠性。在RT-LAMP反应产物中加入染料SYBR GreenⅠ(×1000)可直接观察反应结果。建立的GRSPaV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏、可视化等特点,尤其适合基层使用,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 沙地葡萄茎痘相关病毒 逆反转录环介导恒温扩增技术 快速检测 反转录聚合酶链式反应
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我国部分地区沙地葡萄茎痘相关病毒分离物外壳蛋白序列变异分析 被引量：7
3
作者 朱红娟 胡国君 +3 位作者 范旭东 张尊平 任芳 董雅凤 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期169-175,共7页
为明确我国葡萄中沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)的感染情况及病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因的变异特点,从而为其致病性、病害的防治以及抗病毒基因工程等研究提供依据,本研究对采自我国16个省市自治区的65个葡萄品种305株葡萄样品... 为明确我国葡萄中沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)的感染情况及病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因的变异特点,从而为其致病性、病害的防治以及抗病毒基因工程等研究提供依据,本研究对采自我国16个省市自治区的65个葡萄品种305株葡萄样品中的GRSPaV进行RT-PCR检测,根据地区与品种差异选取了24个阳性样品进行cp基因克隆与测序分析,并对不同RNA提取方法进行了比较。结果显示,114株样品被GRSPaV侵染,平均带毒株率为37.4%;分离物间及同一分离物不同克隆间的序列差异较大,从24个分离物克隆获得的37条cp基因序列与来源于不同国家的12个GRSPaV分离物的核苷酸序列同源性为80.5%~99.7%,氨基酸序列同源性为88.8%~100%;各个分离物的遗传距离无明显地域差异;SiO2吸附法比SDS法和CTAB法更适宜葡萄样品RNA的提取。 展开更多
关键词 沙地葡萄茎痘相关病毒 RT-PCR检测 序列分析
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沙地葡萄茎痘相关病毒在‘阳光玫瑰’葡萄树不同物候期和不同部位的变化规律 被引量：2
4
作者 李美璇 张向昆 +3 位作者 王莉 乔月莲 师校欣 杜国强 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第21期4234-4244,共11页
【背景】沙地葡萄茎痘相关病毒(grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV)是皱木复合病中最常见的一种病毒,主要通过无性繁殖传播,灵敏的检测技术和培育无病毒植株是预防GRSPaV危害的关键。【目的】建立GRSPaV检测体... 【背景】沙地葡萄茎痘相关病毒(grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV)是皱木复合病中最常见的一种病毒,主要通过无性繁殖传播,灵敏的检测技术和培育无病毒植株是预防GRSPaV危害的关键。【目的】建立GRSPaV检测体系,确定适宜样品采集时期及部位,为病毒检测和无病毒材料培育及样品采集提供参考。【方法】建立基于AugeGreen染料法和外壳蛋白(coat protein,CP)基因区域设计引物的RT-qPCR检测方法,对携带GRSPaV的‘阳光玫瑰’葡萄树地上部不同物候期、不同部位的样品进行GRSPaV检出率及基因表达量分析。【结果】以GRS q CP1为引物的GRSPaV RT-qPCR检测方法灵敏度较RT-PCR高10倍。GRSPaV在萌芽期、新梢生长期和花期的检出率均为100%,果实膨大期为91.7%;成熟卷须为94.4%,成龄叶片、成龄叶柄和幼嫩枝条均为100%。检测为阴性的样品均为幼嫩部位。GRSPaV CP基因表达量在花期幼嫩卷须中最高,其次为花期成龄叶片;成龄叶中表达量在果实膨大期至成熟期均为同物候期内表达量最高部位;当年冬芽的萌芽期及二次枝的新梢生长期表达量均较低。【结论】‘阳光玫瑰’葡萄GRSPaV检出率和GRSPaV CP基因表达量随物候期进程表现差异,检出率在萌芽期至花期最高,果实成熟期最低;GRSPaV CP基因表达量在花期最高。综合检出率及表达量因素,花期成龄叶适合作为GRSPaV病毒检测样品;果实膨大期至成熟期当年冬芽及萌发的二次枝适合作为脱除病毒材料。 展开更多
关键词 ‘阳光玫瑰’葡萄 沙地葡萄茎痘相关病毒 实时荧光定量PCR 病毒检出率 基因表达量
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葡萄茎痘伴随病毒cDNA探针检测技术研究 被引量：5
5
作者 牛建新 李西平 +2 位作者 张强 赵英 马兵钢 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期239-243,共5页
选取经RT-PCR检测确认带葡萄茎痘伴随病毒的全球红葡萄品种,以葡萄叶片、皮层作为试材,采用SDS法提取高质量总RNA作为模板,以GRSPaV的特异互补引物引导,反转录合成cDNA,通过PCR扩增,获得830 bp的预期目的片段,并将其克隆测序,其同源性与... 选取经RT-PCR检测确认带葡萄茎痘伴随病毒的全球红葡萄品种,以葡萄叶片、皮层作为试材,采用SDS法提取高质量总RNA作为模板,以GRSPaV的特异互补引物引导,反转录合成cDNA,通过PCR扩增,获得830 bp的预期目的片段,并将其克隆测序,其同源性与NCBI中的相关序列的同源性达96%。利用克隆质粒合成了生物素标记的GRSPaV的cDNA探针,在此基础上,研究了影响GRSPaV斑点杂交的因素,结果表明当探针浓度为200 ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应4 h,可获得较高灵敏度。 展开更多
关键词 葡萄茎痘伴随病毒 CDNA探针 检测
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山东省葡萄几种主要病毒病调查及检测研究 被引量：4
6
作者 王升吉 赵玖华 +4 位作者 尚佑芬 吕志华 张加魁 赵亚 戴争 《北方园艺》 CAS 北大核心 2011年第7期20-23,共4页
对采自山东省不同葡萄园类别的葡萄样品,采用PTA-ELISA法和Dot-ELISA法对葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)进行了检测,采用DAS-ELISA法对葡萄卷叶病的3个毒原(GL-RaV-1-、2-、3)进行了检测。GRSPaV检测结果表明:检测的61个品种518个样品,阳性... 对采自山东省不同葡萄园类别的葡萄样品,采用PTA-ELISA法和Dot-ELISA法对葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)进行了检测,采用DAS-ELISA法对葡萄卷叶病的3个毒原(GL-RaV-1-、2-、3)进行了检测。GRSPaV检测结果表明:检测的61个品种518个样品,阳性样品率33.6%,阳性品种率73.8%,其中资源圃样品阳性率32.7%,生产园样品阳性率34.0%。对检测到阳性样品辅以RT-PCR法验证,2对引物均扩增出了预期片段,分别为解旋酶基因340 bp片段、CP基因842 bp片段。GLRaV-1-、2-、3的检测结果表明:鲜食品种3种病原的阳性样品率分别为33.7%、7.1%、62.2%,酿酒品种阳性样品率分别为35.1%、16.2%、54.1%,综合3种病毒的阳性样品率为76.3%,品种感染率87.7%。通过该类研究对推动国内葡萄无毒化生产有重要意义。 展开更多
关键词 葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV) 葡萄卷叶病毒-1■2■3(GLRaV-1■2■3) 检测 山东
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利用内标为基础的RT-PCR技术检测葡萄茎痘伴随病毒 被引量：2
7
作者 牛建新 李西平 +2 位作者 赵英 张强 马兵钢 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期1083-1086,共4页
选取经RT-PCR检测确认带葡萄茎痘伴随病毒的‘全球红’葡萄品种。以葡萄叶片、韧皮部作为试材,采用SDS法提取高质量总RNA作为模板,以GRSPaV的特异互补引物引导,反转录合成cDNA,通过PCR扩增,获得830bp的预期目的片段。以线粒体nad5基因... 选取经RT-PCR检测确认带葡萄茎痘伴随病毒的‘全球红’葡萄品种。以葡萄叶片、韧皮部作为试材,采用SDS法提取高质量总RNA作为模板,以GRSPaV的特异互补引物引导,反转录合成cDNA,通过PCR扩增,获得830bp的预期目的片段。以线粒体nad5基因为内标,建立了GRSPaV与nad5共扩增体系,将扩增的GRSPaV特异性片段及nad5目的片段分别克隆测序,与NCBI中所提交的核酸序列进行比对,GRSPaV与序列号AF057136的同源性达96%;nad5与序列号D37958的同源性达96·67%。 展开更多
关键词 葡萄茎痘伴随病毒 RT-PCR had5 检测
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