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基于CRISPR-Cas9系统构建GSTZ1基因敲除模型并探索其对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响 被引量：1
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作者 雷冲 王秋杰 +4 位作者 李晶晶 杨帆 梁利 汪凯 唐霓 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1302-1307,共6页
目的:通过CRISPR/Cas9系统在HepG2肝癌细胞系中构建人谷胱甘肽S-转移酶ζ1(glutathione S-transferase zeta,GSTZ1基因敲除模型并探索GSTZ1敲除对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法:设计并合成长度20 bp的靶向GSTZ1的sgRNA寡核苷酸序... 目的:通过CRISPR/Cas9系统在HepG2肝癌细胞系中构建人谷胱甘肽S-转移酶ζ1(glutathione S-transferase zeta,GSTZ1基因敲除模型并探索GSTZ1敲除对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法:设计并合成长度20 bp的靶向GSTZ1的sgRNA寡核苷酸序列,退火后克隆到LentiCRISPR-V2载体上,与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并感染HepG2细胞,用合适浓度的嘌呤霉素筛选阳性细胞株,有限稀释法获得单克隆细胞。所有实验均分成3组:parental组、KO1组和KO2组,采用MTS实验、克隆形成实验和划痕实验分别检测细胞增殖和迁移能力。结果:Western blot和DNA测序鉴定GSTZ1敲除的单克隆细胞构建成功;MTS检测不同时间点下各组HepG2细胞的增殖能力变化情况。结果显示,48 h时,KO1组[(24.758±1.508)%]相比亲本组[(20.185±0.720)%],增殖能力明显增强,差异有统计学意义(P=0.002)。72 h时,相比亲本组[(23.903±0.840)%],KO1组[(28.634±1.848)%]增殖能力明显增强(P=0.014)。96 h和120 h时,KO1组相比亲本对照组,其增殖能力也明显增强(P<0.05)。在KO2细胞中观察到同样现象,说明敲除GSTZ1后能够促进Hep G2细胞的增殖能力。克隆形成实验表明,GSTZ1敲除细胞株(KO1和KO2)克隆形成数(73.330±1.528、82.330±4.163)相比亲本细胞克隆形成数(42.330±2.517)增多,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000),提示GSTZ1基因敲除可以明显促进肝癌细胞的增殖能力。划痕实验结果显示,GSTZ1敲除细胞株KO1和KO2在48 h的迁移相对比分别为0.327±0.041、0.371±0.013,与亲本细胞(0.184±0.045)相比明显增加(P=0.003,P=0.001),提示GSTZ1基因敲除可明显促进肝癌细胞的迁移能力。结论:GSTZ1缺失明显促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,提示GSTZ1可能作为抑癌基因调控肝癌的发生和进程。 展开更多
关键词 gstz1 HEPG2细胞 肝癌 细胞迁移 细胞增殖
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FAH/GSTZ1双基因突变肝细胞模型的建立
2
作者 刘艳 顾鹏 +5 位作者 叶行 梁春锦 关雅今 张映辉 邹庆剑 顾为望 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2022年第8期71-78,共8页
目的采用CRISPR/Cas9技术敲除人LO2肝细胞系的谷胱甘肽S-转移酶Z1(GSTZ1)和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH),探讨GSTZ1和FAH基因敲除对于肝细胞生长、增殖、迁移的影响。方法分别构建靶向GSTZ1和FAH基因的向导RNA(sgRNA)载体,与CRISPR/Cas... 目的采用CRISPR/Cas9技术敲除人LO2肝细胞系的谷胱甘肽S-转移酶Z1(GSTZ1)和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH),探讨GSTZ1和FAH基因敲除对于肝细胞生长、增殖、迁移的影响。方法分别构建靶向GSTZ1和FAH基因的向导RNA(sgRNA)载体,与CRISPR/Cas9载体共转染LO2细胞,通过有限稀释法筛选,基因型鉴定和Western blot实验证实获得的FAH和GSTZ1基因的单基因敲除和双基因敲除三种细胞株。进一步对敲除细胞株表型进行鉴定,通过平板克隆形成实验检测基因敲除肝细胞克隆形成能力;CCK8实验和EdU分析实验测试细胞增殖能力;划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功获得GSTZ1、FAH和FAH/GSTZ1三种基因敲除细胞株。相比于野生型细胞,三种细胞株在增殖能力,克隆形成能力、迁移能力均有显著增加,其中FAH敲除对细胞表型的影响相对较小,GSTZ1敲除对肝细胞活性提高最强,双基因敲除细胞活性处于两个单基因敲除之间。结论我们首次成功建立了FAH/GSTZ1双基因突变肝细胞株,为酪氨酸代谢通路研究和Ⅰ型遗传性酪氨酸血症治疗研究提供了一个新型的细胞模型。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 双基因敲除 gstz1 FAH LO2细胞系
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GSTZ1重组腺病毒的构建及影响肝癌细胞迁移能力的研究
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作者 杨翼 李晶晶 +6 位作者 梁利 高庆祝 郑亚秋 潘娥 汪凯 唐霓 单幼兰 《重庆医科大学学报》 CSCD 北大核心 2017年第7期821-827,共7页
目的:构建人谷胱甘肽-S-转移酶Z1(glutathione S-transferase zeta 1,GSTZ1)重组腺病毒,并初步研究GSTZ1调控粘附连接信号通路(adhesion junction pathway)靶基因SMAD3、IGF1R等影响肝癌细胞的迁移能力。方法:PCR扩增GSTZ1 cDNA序列并... 目的:构建人谷胱甘肽-S-转移酶Z1(glutathione S-transferase zeta 1,GSTZ1)重组腺病毒,并初步研究GSTZ1调控粘附连接信号通路(adhesion junction pathway)靶基因SMAD3、IGF1R等影响肝癌细胞的迁移能力。方法:PCR扩增GSTZ1 cDNA序列并克隆到腺病毒载体pAd Track-TO4,构建重组腺病毒质粒p Ad Track-GSTZ1,将重组质粒用Lipofectamine 2000转染至HEK293细胞中,包装、扩增成高滴度重组腺病毒AdGSTZ1。首先,将SMMC-7721细胞设为3组:Mock组、AdGFP组和AdGSTZ1组,Mock组为空白对照组,AdGFP组为感染腺病毒AdGFP的对照组,AdGSTZ1组为感染腺病毒AdGSTZ1的实验组。然后,通过Transwell实验和MTS实验观察其对肝癌细胞迁移增殖能力的影响,进一步经qRT-PCR及Western blot技术研究GSTZ1通过调控粘附连接信号通路关键分子影响肝癌细胞的迁移。结果:成功构建了高滴度重组腺病毒AdGSTZ1,经Western blot鉴定GSTZ1在SMMC-7721细胞中的表达。Transwell实验结果表明,AdGSTZ1组与Mock组及AdGFP组相比,能够明显抑制人肝癌细胞的迁移能力;与Mock组相比,抑制率为(68.10±1.63)%(P=0.000),与AdGFP组相比,抑制率为(50.70±0.99)%(P=0.000)。MTS实验结果表明,AdGSTZ1组在72 h和96 h的吸光度值分别为(1.13±0.08)和(1.28±0.07),AdGFP组72 h和96 h的吸光度值分别为(1.28±0.03)和(1.45±0.03),AdGSTZ1组在96 h的吸光度值与对照组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。另外q RT-PCR及Western blot结果显示,与Mock组和AdGFP组相比,AdGSTZ1感染细胞内粘附连接信号通路中靶基因SMAD3、IGF1R等的表达明显降低。q RT-PCR结果显示,AdGSTZ1组与AdGFP组相比,TGFBR1相对表达量为(0.58±0.13)(t=4.609,P=0.010),SMAD3相对表达量为(0.51±0.08)(t=8.030,P=0.000),ERBB2相对表达量为(0.46±0.09)(t=9.384,P=0.000),IGF1R相对表达量为(0.45±0.02)(t=14.480,P=0.000),FARP2相对表达量为(0.37±0.13)(t=7.082,P=0.028)。Western blot表明,SMAD3组中,AdGFP组的蛋白相对表达量为(0.96±0.18),AdGS 展开更多
关键词 gstz1 SMMC-7721细胞 粘附连接信号通路 肝癌 细胞迁移
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