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活细胞内人IGFBP2-3’UTR基因的GFP—MS2荧光系统标记
1
作者 付雪 高星杰 +6 位作者 张毅 史雪彬 辛灵彪 刘欣 于林 杨洁 何津岩 《医学分子生物学杂志》 CAS 2014年第1期7-11,16,共6页
目的利用GFP—MS2系统在活细胞内对胰岛素样生长因子结合蛋白2（insulin-hke growth factor，bindin gprotein2，IGFBP2）mRNA3’非翻译区（3’untranslated region，3’UTR）进行绿色荧光标记，构建pT-／-IGFBP2-3’UTR-24×MS2重... 目的利用GFP—MS2系统在活细胞内对胰岛素样生长因子结合蛋白2（insulin-hke growth factor，bindin gprotein2，IGFBP2）mRNA3’非翻译区（3’untranslated region，3’UTR）进行绿色荧光标记，构建pT-／-IGFBP2-3’UTR-24×MS2重组质粒。方法提取HeLa细胞总RNA，以针对IGFBP2-3’非翻译区的特异性片段为反转录引物，反转录出cDNA，并以其为模板，降落PCR法扩增出带有EcoRI和BamHI双酶切位点的1GFBP2—3’UTR目的基因，再利用双酶切法将目的片段连接到psG5载体（启动子为T7）上，构建重组质粒pT-／．IGFBP2-3’UTR；同时。以BglII和BamHI双酶切法从pCR4-24xMS2SL．stable质粒上切下24×MS2结合位点片段并将其插入pT7-IGFBP2-3’UTR，构建重组质粒pT7-IGFBP2-3’UTR-24×MS2；然后将构建的重组质粒pT7-IGFBP2-3’UTR-24×MS2、pMS2．GFP质粒与pERFP-Tudor-SN质粒共同转染人HeLa细胞内，以激光共聚焦荧光显微镜检测IGFBP2—3’UTR的荧光标记情况及应激共定位。结果以酶切质粒法及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误．激光共聚焦结果显示在胞浆中检测到IGFBP2．3’UTR的绿色荧光信号，在细胞受到氧化应激时IGFBP2—3’UTR信号呈颗粒状聚集，且与应激颗粒（stressgranules，SGs）的标志蛋白Tudor-SN呈共定位关系。结论针对IGFBP2—3’UTR的GFP-MS2荧光标记系统质粒构建成功；细胞应激时，ICFBP2-3’UTR被招募至sGs结构中。 展开更多
关键词 IGFBP2 3’UTR gfp-ms2 重组质粒 应激颗粒
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基于MS2衣壳蛋白系统的活细胞内Jun mRNA定位初探
2
作者 黄静 李凤磊 +4 位作者 万传璐 张彦 曹诚 张部昌 赵志虎 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期737-739,758,共4页
目的检测细胞中Jun mRNA在活细胞内的定位。方法设计引物,构建融合MS2茎环结构串联重复的Jun表达载体(pcDNA3.1-Jun-MS2-48X)。转染细胞后,绿色荧光蛋白(GFP)-MS2融合蛋白可与MS2茎环串联重复结构结合,通过荧光显微镜观察GFP的细胞定位... 目的检测细胞中Jun mRNA在活细胞内的定位。方法设计引物,构建融合MS2茎环结构串联重复的Jun表达载体(pcDNA3.1-Jun-MS2-48X)。转染细胞后,绿色荧光蛋白(GFP)-MS2融合蛋白可与MS2茎环串联重复结构结合,通过荧光显微镜观察GFP的细胞定位,能够间接确定Jun mRNA在细胞内的定位。结果成功构建了pcDNA3.1-Jun-MS2-48X表达载体,经荧光显微镜观察,能够看到明显的绿色荧光,并且在细胞内聚集。结论实现了在细胞内实时观察Jun mRNA,为在单细胞水平上Jun mRNA的定位提供了新的技术方法。 展开更多
关键词 gfp—ms2融合蛋白 mRNA胞内定位 RNA-蛋白相互作用 JUN
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