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差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞 被引量：8
1
作者 李甫强 周鸿鹰 +4 位作者 羊惠君 项涛 梅妍 胡火珍 王廷华 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期301-304,共4页
目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴... 目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。另外,选4h、8h、24h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2h的细胞纯度高,但细胞密度低;24h后的细胞密度高而纯度低;8h后的细胞密度大具有较高的纯度。传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。 展开更多
关键词 差速贴壁法 分离纯化 骨髓问充质干细胞 gfp转基因小鼠
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脂肪组织来源干细胞定向分化脂肪组织的体内外实验研究 被引量：8
2
作者 鲁峰 高建华 +2 位作者 水野博司 小川令 百束比古 《中华整形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期412-416,共5页
目的 分离和培养脂肪组织来源干细胞（ASCs），鉴定其是否具有干细胞表面标志，研究携带GFP基因的ASCs向脂肪组织的体外定向诱导分化能力，同时判断种子细胞ASCs与Ⅰ型胶原支架混合培养后在体内构建组织工程化脂肪组织的可能性。方法 取... 目的 分离和培养脂肪组织来源干细胞（ASCs），鉴定其是否具有干细胞表面标志，研究携带GFP基因的ASCs向脂肪组织的体外定向诱导分化能力，同时判断种子细胞ASCs与Ⅰ型胶原支架混合培养后在体内构建组织工程化脂肪组织的可能性。方法 取GFP小鼠腹股沟部脂肪组织，使用酶消化法进行原代培养，流式细胞仪鉴定其表面干细胞标志，细胞传至第3代后使用脂肪分化培养基诱导2周，观察细胞形态及功能变化。将诱导分化后的细胞与支架材料混合培养后12h，将支架材料移植到裸鼠背部皮下，观察新生组织情况，并对新生组织使用HE及油红O染色进行鉴定。结果 原代培养的ASC形态类似于成纤维细胞，具有很强的增殖能力，能持续稳定表达表面干细胞标志。在脂肪分化培养基的作用下，胞浆内脂滴不断聚集，逐渐演变为成熟的脂肪细胞，油红O染色阳性。体内实验中在裸鼠皮下发现了0．5ml的新生组织块，常规病理及油红O染色均证实其为成熟脂肪组织块。结论 脂肪组织来源的干细胞ASC能在体外定向诱导分化为成熟脂肪细胞，且ASC能作用种子细胞与Ⅰ型胶原支架在体内成功构建脂肪组织。 展开更多
关键词 脂肪组织来源干细胞 组织工程 gfp转基因小鼠
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神经干细胞改善阿尔茨海默氏病转基因小鼠的学习和记忆能力 被引量：2
3
作者 吴树亮 李会平 +3 位作者 孔建 李鑫磊 陈明伟 杨慧科 《解剖科学进展》 CAS 2013年第4期342-345,350,共5页
目的本研究将绿色荧光蛋白(green fluorecent protein,GFP)转基因小鼠神经干细胞(neural stemcells,NSCs)移植到阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)转基因小鼠海马中,探讨NSCs在AD治疗中的作用。方法 E14-17d的GFP转基因小鼠的... 目的本研究将绿色荧光蛋白(green fluorecent protein,GFP)转基因小鼠神经干细胞(neural stemcells,NSCs)移植到阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)转基因小鼠海马中,探讨NSCs在AD治疗中的作用。方法 E14-17d的GFP转基因小鼠的NSCs被分离、培养并诱导分化为神经细胞,相差显微镜和免疫细胞化学染色检测NSCs的表型与分化情况。通过显微注射,将GFP转基因小鼠的NSCs移植到AD转基因小鼠海马内,并以Morris水迷宫实验和旷场试验检测宿主鼠学习记忆能力的改善程度。结果培养的NSCs具有自我增殖能力,并可分化为神经元和星形胶质细胞。NSCs移植后,表达GFP的神经干细胞有效整合至宿主小鼠的海马组织内,并使宿主小鼠的学习和记忆能力明显改善。结论神经干细胞移植可改善阿尔茨海默氏病转基因小鼠的学习和记忆能力。 展开更多
关键词 神经干细胞 gfp转基因小鼠 阿尔茨海默氏病转基因小鼠 旷场实验 MORRIS水迷宫
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绿色荧光蛋白转基因小鼠诱导肝癌模型的建立
4
作者 孙忠亮 罗殿中 +2 位作者 邝晓聪 党裔武 蔡捷 《中国癌症防治杂志》 CAS 2012年第2期114-119,共6页
目的建立绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因小鼠肝癌模型,观察GFP蛋白在诱癌过程中荧光的变化。方法采用二乙基亚硝胺(diethylnitrosa mine,DENA)/四氯化碳(CCL4)/乙醇/DENA诱导肝癌共20周,实验组50只和对照组10只均为... 目的建立绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因小鼠肝癌模型,观察GFP蛋白在诱癌过程中荧光的变化。方法采用二乙基亚硝胺(diethylnitrosa mine,DENA)/四氯化碳(CCL4)/乙醇/DENA诱导肝癌共20周,实验组50只和对照组10只均为GFP转基因小鼠。每周监测小鼠体重的变化;常规HE染色动态观察病理组织学;第4、12、16周处死小鼠取肝组织制作冷冻切片观察荧光表达,并以石蜡HE染色观察病理变化;第20周时处死小鼠取其肝肿物进行原代培养,观察肿瘤细胞中荧光表达和分布。结果实验组GFP转基因小鼠死亡15只,死亡率30%(15/50)。对照组10只小鼠未发生死亡。GFP转基因小鼠在诱癌的第4、12、16、20周依次出现肝炎,肝硬化、癌前病变和癌变等。荧光显微镜下观察到诱癌开始前、第4周、第12周和第16周肝脏组织的冷冻切片有GFP蛋白的表达,诱癌第20周肝肿物原代培养中肿瘤细胞的细胞质和细胞核中有GFP蛋白表达。结论本实验成功建立GFP转基因小鼠肝癌发生的动物模型,可动态观察肝癌细胞中GFP蛋白的表达。 展开更多
关键词 gfp转基因小鼠 肝癌模型 gfp蛋白表达
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绿色荧光蛋白转基因小鼠用作hprt基因突变试验动物模型的研究 被引量：1
5
作者 李永红 杨录军 +2 位作者 刘文斌 曹佳 刘晋祎 《癌变．畸变．突变》 CAS CSCD 2013年第4期306-310,共5页
目的:探讨绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因小鼠用作hprt基因突变试验动物模型的可能性。方法:用乙基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)诱导GFP转基因小鼠和普通小鼠基因突变,比较诱导后两种小鼠的嗜多染红细胞微... 目的:探讨绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因小鼠用作hprt基因突变试验动物模型的可能性。方法:用乙基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)诱导GFP转基因小鼠和普通小鼠基因突变,比较诱导后两种小鼠的嗜多染红细胞微核率变化情况。再观察GFP小鼠细胞克隆对GFP转基因小鼠hprt基因的DNA和mRNA序列进行验证,并对GFP转基因小鼠hprt突变克隆外显子1和外显子9进行了双向测序。结果:ENU诱导后GFP转基因小鼠和普通小鼠的微核率变化趋势相同。GFP转基因小鼠的微孔培养物比普通小鼠的微孔培养物易于确认,且降低了假阳性率和假阴性率。GFP转基因小鼠的hprt基因是完整的,与普通小鼠相比未见明显差异。GFP转基因小鼠hprt基因6个突变克隆外显子1的序列均与野生型小鼠细胞的序列一致,3个突变克隆外显子9的序列中有2个发生了A∶T→T∶A颠换。结论:ENU诱导的GFP转基因小鼠突变模型良好,GFP转基因小鼠可用作小鼠淋巴细胞hprt基因突变试验的动物模型,准确性高且试验难度低。 展开更多
关键词 gfp转基因小鼠 却—基因突变试验 动物模型 遗传毒性
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GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植
6
作者 王亚萍 孔祥平 +4 位作者 刘光泽 卓丽 高洪波 唐小平 佟明华 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2018年第25期4071-4076,共6页
背景:近年研究证实,干细胞移植的成功与否、移植后细胞功能的发挥均与体内微环境密切相关。正常生理情况下,肝脏不易接受外源性细胞,因此,在目前的细胞移植研究中,通常会先建立一个移植动物模型,通过造成宿主肝脏的损伤或降低宿主肝脏... 背景:近年研究证实,干细胞移植的成功与否、移植后细胞功能的发挥均与体内微环境密切相关。正常生理情况下,肝脏不易接受外源性细胞,因此,在目前的细胞移植研究中,通常会先建立一个移植动物模型,通过造成宿主肝脏的损伤或降低宿主肝脏的免疫反应等方式,为外源细胞的植入和增殖创造一个良好的移植条件。目的:观察GFP转基因小鼠胎肝干细胞在脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐/倒千里光碱联合1/3肝切除(L-CL2MDP/RS/PH)模型大鼠肝脏内的定植和分布情况。方法:(1)以孕15 d GFP转基因小鼠为供体,分离培养胎肝干细胞,荧光显微镜观察GFP表达,并行免疫细胞化学鉴定;(2)将30只SD大鼠随机分为实验组和对照组,实验组腹腔注射倒千里光碱溶液(30 mg/kg,共2次,每次间隔2周),术前1 d每只大鼠静脉注射1 m L脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐(L-CL2MDP)溶液,行1/3部分肝脏切除后经脾内移植GFP转基因小鼠胎肝干细胞,对照组用生理盐水分别代替L-CL2MDP和倒千里光碱溶液,不进行1/3部分肝脏切除;(3)移植后3,15,30 d取出两组大鼠肝脏行冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP阳性肝干细胞在大鼠肝脏的分布,并通过免疫组化染色方法检测抗小鼠C-Kit抗体在移植大鼠肝内的表达。结果与结论:(1)镜下观察分离的肝干细胞大小均匀,呈鹅卵石形态。培养5 d后细胞体积逐渐增大,呈类圆形或梭形,荧光显微镜下可见绿色荧光,免疫细胞化学检测第3代肝干细胞表达CD34、AFP;(2)胎肝干细胞移植后3 d在荧光显微镜下发现实验组大鼠肝内散在分布GFP阳性细胞,移植后30 d大鼠肝脏内仍可见GFP阳性表达;(3)移植后3,15,30 d在实验组大鼠肝脏组织可见C-Kit阳性细胞表达;(4)结果表明,GFP转基因小鼠胎肝干细胞成功移植于L-CL2MDP/RS/PH模型大鼠脾内,植入的细胞能够在大鼠肝脏中存活,并出现不同程度增殖。 展开更多
关键词 gfp转基因小鼠 胎肝干细胞 倒千里光碱 脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐 1/3部分肝脏切除 脾内移植 干细胞 肝 干细胞 小鼠 转基因 组织工程
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人参皂苷Rg_1对D-半乳糖所致衰老小鼠海马的保护机制 被引量：29
7
作者 向玥 陈粼波 +7 位作者 姚辉 陈雄斌 刘颖 汪子铃 熊丽溶 王璐 王顺和 王亚平 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2017年第18期3789-3795,共7页
目的探讨人参皂苷Rg_1对D-半乳糖(D-gal)所致衰老小鼠海马的保护机制。方法 6~8周龄雄性C57BL/6J巢蛋白(Nestin)-绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠随机分为4组,每组10只,分别为对照组、人参皂苷Rg_1对照组、人参皂苷Rg_1治疗组、模型组。衰... 目的探讨人参皂苷Rg_1对D-半乳糖(D-gal)所致衰老小鼠海马的保护机制。方法 6~8周龄雄性C57BL/6J巢蛋白(Nestin)-绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠随机分为4组,每组10只,分别为对照组、人参皂苷Rg_1对照组、人参皂苷Rg_1治疗组、模型组。衰老模型建立与给药完成后第2天,水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力;取小鼠海马制备冷冻组织切片,观察海马区神经干细胞Nestin荧光强度;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法检测海马细胞衰老;酶标比色法检测海马组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)的量;ELISA检测海马组织匀浆中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的量;蛋白印迹法检测海马组织中p53、p21蛋白表达。结果与模型组比较,人参皂苷Rg_1对照组和人参皂苷Rg_1治疗组小鼠空间学习记忆能力明显增强;海马齿状回(DG区)Nestin荧光强度增高;海马齿状回(CA3区)SA-β-gal染色阳性细胞百分比显著降低;海马组织匀浆中SOD活性与T-AOC显著增加、MDA量下降;IL-1β、IL-6和TNF-α量减少;p53、p21蛋白表达降低。结论人参皂苷Rg_1具有拮抗D-gal所致衰老小鼠海马损伤和延缓海马衰老的作用,其机制可能与抑制氧化应激及下调其下游p53-p21信号通路有关。 展开更多
关键词 人参皂苷Rg1 D-半乳糖 衰老模型 Nestin-gfp转基因小鼠 海马 抗氧化
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GAD67-GFP转基因小鼠脑干内向小脑皮层的GABA能投射
8
作者 廖衡 王智明 +3 位作者 王文 陈涛 武胜昔 李云庆 《第四军医大学学报》 北大核心 2006年第24期2297-2299,共3页
目的:观察向小鼠小脑皮层投射的γ-氨基丁酸(GABA)能神经元在脑干内的分布.方法:四甲基罗达明(TMR)逆行追踪和免疫荧光组织化学相结合的双重标记方法,结果在激光共聚焦显微镜下观察.结果:将TMR注入小脑皮层后,TMR逆标神经元主要见于三... 目的:观察向小鼠小脑皮层投射的γ-氨基丁酸(GABA)能神经元在脑干内的分布.方法:四甲基罗达明(TMR)逆行追踪和免疫荧光组织化学相结合的双重标记方法,结果在激光共聚焦显微镜下观察.结果:将TMR注入小脑皮层后,TMR逆标神经元主要见于三叉神经脊束核(SP5),前庭上核(SuVe),前庭脊核(SpVe),前庭内侧核(MVe),前庭外侧核(LVe),耳蜗腹侧核(VC),耳蜗背侧核(DC),外侧上橄榄核(LSO),下橄榄主核(IOPr),下橄榄内侧核(IOM),下橄榄背侧核(IOD);GFP阳性神经元主要位于SuVe,MVe,LVe,DC,LSO,VC,SP5,SpVe,IOPr,小细胞网状核(PCRt),巨细胞网状核(Gi),在IOM和IOD内也能见到一些GFP阳性神经元;TMR/GFP双标神经元主要位于SuVe,MVe,LVe,DC,VC,SP5,SpVe,IOPr,在LSO,IOM和IOD内也能见到一些TMR/GFP双标神经元.结论:向小脑皮层投射的GABA能神经元在脑干内的分布比较广泛,它们可能参与了小脑对运动的调控. 展开更多
关键词 Γ-氨基丁酸 小脑皮质 脑干 免疫荧光组织化学 GAD67-gfp转基因小鼠
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西南干细胞研究计划正式启动
9
《昆明医学院学报》 2004年第1期37-37,共1页
关键词 西南干细胞研究计划 启动 干细胞研究中心 昆明医学院神经科学研究所 gfp转基因小鼠
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流式细胞仪分选thy1-GFP-J转基因小鼠皮层及海马神经元 被引量：1
10
作者 余樱 任庆国 +1 位作者 解翠红 王伟 《卒中与神经疾病》 2008年第5期264-267,共4页
目的获得活体哺乳动物脑内单一纯化的神经元群。方法用RT-PCR和激光共聚焦显微镜扫描脑片鉴定thy1-GFP-J转基因小鼠,取2月龄鉴定阳性小鼠皮层和海马组织,应用番木瓜蛋白酶分离系统制备脑组织单细胞悬液,PI标记死亡细胞,流式细胞仪荧光... 目的获得活体哺乳动物脑内单一纯化的神经元群。方法用RT-PCR和激光共聚焦显微镜扫描脑片鉴定thy1-GFP-J转基因小鼠,取2月龄鉴定阳性小鼠皮层和海马组织,应用番木瓜蛋白酶分离系统制备脑组织单细胞悬液,PI标记死亡细胞,流式细胞仪荧光激活细胞分类技术(FACS)分选收集GFP+和PI-的存活神经元,并抽提获得细胞的RNA和蛋白。结果阳性转基因小鼠DNA的PCR扩增鉴定显示为内参(324bp)和所转基因(173bp)两条带,脑片的激光共聚焦扫描结果显示海马和皮层均可见大小较均一的圆点状绿色荧光。经FACS分选后的细胞几乎全都发出绿色荧光,每次产量约为0.5～1×106个存活神经元。获得的纯化神经元中抽提的RNA和蛋白可用于RT-PCR和westernblot检测。结论利用FACS可以从thy1-GFP-J转基因小鼠脑内获得单一纯化的存活神经元群。该技术的应用将为活体神经元细胞特异性的基因表达和蛋白定量分析研究提供一个可行方案。 展开更多
关键词 流式细胞仪 荧光激活细胞分类术 thyl-gfp-J转基因小鼠 神经元
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