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猪链球菌WC-SS7株GDH基因的表达及GDH蛋白单克隆抗体的制备 被引量：4
1
作者 王淑杰 徐敏 +7 位作者 蔡雪辉 武佳斌 刘永刚 王洪峰 石文达 李丽琴 徐明明 荣福龙 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期980-983,共4页
目的原核表达猪链球菌7型临床分离株WC-SS7的GDH蛋白,制备抗GDH蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法将临床分离的猪链球菌7型WC-SS7株的GDH基因克隆入表达载体pET-30a,转入大肠杆菌中,用IPTG诱导表达,用Ni化琼脂糖柱(Pierce)纯化的GDH蛋白免疫B... 目的原核表达猪链球菌7型临床分离株WC-SS7的GDH蛋白,制备抗GDH蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法将临床分离的猪链球菌7型WC-SS7株的GDH基因克隆入表达载体pET-30a,转入大肠杆菌中,用IPTG诱导表达,用Ni化琼脂糖柱(Pierce)纯化的GDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,对抗WC-SS7GDH蛋白单克隆抗体进行特异性鉴定及亚型鉴定。结果表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析后,在约为52KD处可见一条明显的诱导表达带,说明GDH蛋白得到了正确的表达;细胞融合后检测为阳性的细胞株经过3次单克隆筛选,最终得到了6株能和GDH蛋白反应的能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,这些单抗通过Western鉴定结果显示其具有良好的特异性,6株单克隆抗体亚型鉴定结果显示其亚型均为IgG1型,且轻链均为κ链。结论本研究成功表达了WC-SS7的GDH蛋白,并获得了6株能和GDH蛋白反应的、能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,所获得的重组GDH蛋白及特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究,为猪链球菌临床感染血清学诊断方法的建立奠定基础。 展开更多
关键词 猪链球菌 gdh蛋白 原核表达 单克隆抗体
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动物组织中GLUD1基因表达与GDH蛋白结构分析
2
作者 徐鸿洋 徐晶 +2 位作者 房君 德宝军 周欢敏 《畜牧与饲料科学》 2021年第4期7-12,24,共7页
[目的]研究动物不同组织中GLUD1基因的表达情况,比较不同物种中GDH蛋白的结构差异,明晰GLUD1基因的表达模式与GDH蛋白的功能。[方法]分别采集大鼠、绵羊、梅花鹿的肝脏、肾脏、皮肤、脂肪和肌肉5种新鲜组织样品。以β-actin为内参基因,... [目的]研究动物不同组织中GLUD1基因的表达情况,比较不同物种中GDH蛋白的结构差异,明晰GLUD1基因的表达模式与GDH蛋白的功能。[方法]分别采集大鼠、绵羊、梅花鹿的肝脏、肾脏、皮肤、脂肪和肌肉5种新鲜组织样品。以β-actin为内参基因,采用荧光定量PCR法(qRT-PCR)分析3种动物不同组织中GLUD1基因的表达情况;利用无重复双因素分析方法表征GLUD1基因在不同组织中的表达量差异。比较人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛和猪7个物种GDH蛋白氨基酸序列,模拟这7个物种的GDH蛋白三维空间结构。[结果]GLUD1基因在大鼠、绵羊和梅花鹿的5个组织中均有表达,在肝脏中的表达量均高于其他组织;该基因在大鼠和梅花鹿肝脏组织中的表达量极显著(P<0.01)高于绵羊肝脏组织中的表达量,在大鼠肾脏组织中的表达量极显著(P<0.01)高于梅花鹿肾脏组织中的表达量。人GDH蛋白的氨基酸序列与猪、牛、山羊和绵羊的序列相似度较高,而大鼠与小鼠GDH蛋白的氨基酸序列相似度达到99.10%。大鼠、人、猪的GDH蛋白氨基酸序列中分别存在2个(第8位丙氨酸→缬氨酸、第40位丙氨酸→缬氨酸)、1个(第23位丙氨酸→丝氨酸)、2个(第33位丙氨酸→苏氨酸、第39位丙氨酸→苏氨酸)物种特异性突变位点。小鼠、大鼠、人的GDH蛋白预测为三聚体结构,山羊、绵羊、牛和猪的GDH蛋白预测为同源六聚体结构。[结论]GLUD1基因在大鼠、绵羊、梅花鹿不同组织中的表达量存在差异,在肝脏中都有较高水平的表达。不同物种GDH蛋白的氨基酸序列相似度较高,但依旧存在一定的序列差异性,并且存在数个对应物种特异性的氨基酸突变位点。 展开更多
关键词 GLUD1基因 QRT-PCR 差异表达 肝脏 gdh蛋白
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猪链球菌重组GDH蛋白间接ELISA检测方法的建立 被引量：6
3
作者 徐敏 王淑杰 +4 位作者 蔡雪辉 刘永刚 石文达 武佳斌 李丽琴 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期623-626,共4页
为建立猪链球菌快速诊断方法,本研究以纯化的原核表达的猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白(GDH)为抗原,建立了检测猪链球菌抗体的间接ELISA诊断方法。实验确定了最佳抗原包被浓度为6μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,其作用时间为60min,兔... 为建立猪链球菌快速诊断方法,本研究以纯化的原核表达的猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白(GDH)为抗原,建立了检测猪链球菌抗体的间接ELISA诊断方法。实验确定了最佳抗原包被浓度为6μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,其作用时间为60min,兔抗猪酶标抗体的最佳稀释倍数为1∶2000,其作用时间为60min;判定标准为S/P值≥0.210时判为阳性,S/P值≤0.166时判为阴性,介于两者之间的判为可疑。实验结果表明该方法特异性、敏感性和重复性均较好,适用于猪链球菌所有亚型的抗体检测,为猪链球菌的流行病学调查提供了一种简便快速的血清学检测方法。 展开更多
关键词 猪链球菌 重组gdh蛋白 间接ELISA 检测方法
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