鸭3型腺病毒(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)为近年来新发的以引起鸭肝脏肿大出血、肾脏大面积出血点为特征的鸭群新发疫病。为建立特异性的检测DAdV-3的PCR方法,研究通过分析鸭群中鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭源禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸭...鸭3型腺病毒(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)为近年来新发的以引起鸭肝脏肿大出血、肾脏大面积出血点为特征的鸭群新发疫病。为建立特异性的检测DAdV-3的PCR方法,研究通过分析鸭群中鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭源禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸭2型腺病毒(DAdV-2)和DAdV-3的Fiber 2基因特征,建立特异性检测DAdV-3的PCR方法。结果显示:优化后的PCR方法最佳退火温度为54℃,对DAdV-3扩增片段大小为548 bp;敏感性强,最低检测限为36.4 pg;特异性好,对DAdV-A、FAdV-4、鸭病毒性肠炎(DEV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭圆环病毒(DuCV)和鹅多瘤病毒(GHPV)均无特异性扩增。表明该方法可有效用于开展新发DAdV-3的流行病学调查。展开更多
为建立鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR诊断方法,本试验根据DAdV-3基因组序列中相对保守的Fiber-2基因,通过普通PCR扩增,构建pMD19-Fiber2重组质粒为阳性标准品,在此基础上设计合成特异性...为建立鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR诊断方法,本试验根据DAdV-3基因组序列中相对保守的Fiber-2基因,通过普通PCR扩增,构建pMD19-Fiber2重组质粒为阳性标准品,在此基础上设计合成特异性引物进行实时荧光定量PCR方法的建立,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,针对DAdV-3的Fiber-2基因建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法线性关系良好,相关系数0.9989;检测DAdV-3的灵敏度为3.6×10^(2)copies/μL,敏感性比普通PCR检测方法高100倍;该方法对鸭腺病毒1型、鸭疫里默杆菌等其他常见病原均无交叉扩增反应,批内、批间变异系数均小于5%;临床样本检测与普通PCR符合率100%。以上结果表明,所建方法特异性强、敏感性高且重复性好,适用于临床检测,该方法可为DAdV-3的临床诊断、流行病学调查以及防控提供技术支持。展开更多
为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,...为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,重组质粒标准品pMD19-Fiber在1×10^(3)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL时和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R~2=0.995,扩增效率为90%。利用建立的qPCR方法对鸽II型腺病毒(PIAdV-II)Fiber 2基因保守区质粒标准品、鸽圆环病毒(PICV)、新城疫病毒(NDV)、多杀性巴氏杆菌(PM)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的检测结果均为阴性,仅PIAdV-I检测为阳性,特异性强;该方法对浓度为1×10^(0)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL的重组质粒标准品进行检测,结果显示最低检测限为1×10^(2)拷贝/μL,而普通PCR最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,表明qPCR方法的敏感性更强;该方法批内、批间重复性试验的变异系数分别小于1%和2%,重复性好。利用建立的qPCR方法和普通PCR方法对从呼和浩特市某赛鸽公棚随机采集的30份鸽肝脏样品进行PIAdV-I检测,结果显示前者的阳性检测率为63.3%(19/30),普通PCR方法的阳性率为36.7%(11/30),两种方法的阳性符合率均为100%。本研究首次建立PIAdV-I的q PCR检测方法,为鸽PIAdV-I的感染提供了敏感、快速的检测手段。展开更多
文摘为建立鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR诊断方法,本试验根据DAdV-3基因组序列中相对保守的Fiber-2基因,通过普通PCR扩增,构建pMD19-Fiber2重组质粒为阳性标准品,在此基础上设计合成特异性引物进行实时荧光定量PCR方法的建立,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,针对DAdV-3的Fiber-2基因建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法线性关系良好,相关系数0.9989;检测DAdV-3的灵敏度为3.6×10^(2)copies/μL,敏感性比普通PCR检测方法高100倍;该方法对鸭腺病毒1型、鸭疫里默杆菌等其他常见病原均无交叉扩增反应,批内、批间变异系数均小于5%;临床样本检测与普通PCR符合率100%。以上结果表明,所建方法特异性强、敏感性高且重复性好,适用于临床检测,该方法可为DAdV-3的临床诊断、流行病学调查以及防控提供技术支持。
文摘为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,重组质粒标准品pMD19-Fiber在1×10^(3)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL时和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R~2=0.995,扩增效率为90%。利用建立的qPCR方法对鸽II型腺病毒(PIAdV-II)Fiber 2基因保守区质粒标准品、鸽圆环病毒(PICV)、新城疫病毒(NDV)、多杀性巴氏杆菌(PM)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的检测结果均为阴性,仅PIAdV-I检测为阳性,特异性强;该方法对浓度为1×10^(0)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL的重组质粒标准品进行检测,结果显示最低检测限为1×10^(2)拷贝/μL,而普通PCR最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,表明qPCR方法的敏感性更强;该方法批内、批间重复性试验的变异系数分别小于1%和2%,重复性好。利用建立的qPCR方法和普通PCR方法对从呼和浩特市某赛鸽公棚随机采集的30份鸽肝脏样品进行PIAdV-I检测,结果显示前者的阳性检测率为63.3%(19/30),普通PCR方法的阳性率为36.7%(11/30),两种方法的阳性符合率均为100%。本研究首次建立PIAdV-I的q PCR检测方法,为鸽PIAdV-I的感染提供了敏感、快速的检测手段。
