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兔源F型多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：5
1
作者 王锦祥 林松华 +5 位作者 陈冬金 孙世坤 陈岩锋 高承芳 桑雷 谢喜平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期156-160,共5页
为建立特异性强且敏感性高的兔源F型多杀性巴氏杆菌(Pm)快速检测方法,本实验根据F型Pm fcbD基因的保守序列设计特异性引物和探针,经反应条件优化,建立了检测兔源F型Pm的荧光定量PCR方法。利用该方法检测兔源F型Pm、兔源A和D型Pm、支气... 为建立特异性强且敏感性高的兔源F型多杀性巴氏杆菌(Pm)快速检测方法,本实验根据F型Pm fcbD基因的保守序列设计特异性引物和探针,经反应条件优化,建立了检测兔源F型Pm的荧光定量PCR方法。利用该方法检测兔源F型Pm、兔源A和D型Pm、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌等临床常见兔源病原菌,结果显示,该方法仅对兔源F型Pm检测为阳性,其余病原菌均为阴性,特异性强。利用该方法分别检测10倍倍比稀释(1×10^(8)拷贝/μL~1×10^(0)拷贝/μL)的兔源F型Pm基因组DNA,进行敏感性试验,结果显示该方法的检测限为10拷贝/μL,敏感性分别是已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的100倍和10倍,敏感性高。利用该方法对不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验,结果显示,批内和批间变异系数均小于3%,重复性好。利用该方法检测64份已知结果的临床样品,结果显示该方法的检测结果与已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法检测结果的符合率均为100%,准确性高。本研究首次以fcbD为靶基因建立兔源F型Pm的荧光定量PCR检测方法,为兔源F型Pm的检测提供了有力的技术手段。 展开更多
关键词 兔 f型多杀性巴氏杆菌 fcbD基因 荧光定量PCR方法
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兔源F型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立 被引量：5
2
作者 王锦祥 孙世坤 +3 位作者 陈岩峰 陈冬金 桑雷 谢喜平 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期501-505,共5页
【目的】建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,为兔巴氏杆菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列分别设计了2对引物进行双重PCR扩增,对双重PCR检测方法的退火... 【目的】建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,为兔巴氏杆菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列分别设计了2对引物进行双重PCR扩增,对双重PCR检测方法的退火温度和混合引物浓度进行优化,并对方法的特异性、敏感性、重复性和准确性进行验证。【结果】该双重PCR方法最优反应条件为:退火温度60℃、混合引物浓度0.8μmol·L^(−1)。该双重PCR方法能扩增出兔源F型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp)和fcbD基因片段(490 bp)、兔源A和D型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp),对兔源支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照均为阴性,无交叉反应,特异性较强。该方法对兔源F型多杀性巴氏杆菌的最低检出限为1×10^(3)拷贝·μL^(−1),敏感性高。应用该方法对90份病死兔肺脏样品进行批内和批间重复性试验,结果均一致,重复性好。应用该双重PCR方法和已报道的多重PCR方法同时检测87份已知结果的呼吸道病死兔肺脏样品,结果显示双重PCR方法检测结果和已报道的多重PCR方法检测结果与已知结果的符合率分别为97.70%和94.25%,双重PCR方法检测结果与已报道的多重PCR方法检测结果的符合率为93.10%,双重PCR方法的准确性更高。【结论】针对多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性,为兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测提供了技术支撑。 展开更多
关键词 兔 f型多杀性巴氏杆菌 kmt1基因 fcbD基因 双重PCR检测方法
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兔源F型多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立 被引量：4
3
作者 王锦祥 孙世坤 +3 位作者 陈岩峰 陈冬金 桑雷 谢喜平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期490-495,共6页
为了建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测方法,本试验根据F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列设计了2对特异性引物,经反应条件优化,建立了检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。结果显示,该LAMP快速检... 为了建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测方法,本试验根据F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列设计了2对特异性引物,经反应条件优化,建立了检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。结果显示,该LAMP快速检测方法的最优反应条件为:外引物和内引物的浓度比为1∶7、反应温度为65℃、反应时间为60 min。该方法特异性强,对兔源A型和D型多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照(灭菌ddH_(2)O)均无交叉反应。该方法敏感性高,最低检出限为1×10^(2)拷贝/μL的兔源F型多杀性巴氏杆菌基因组DNA,是普通PCR方法的10倍。此外,该方法重复性好,准确性高。该方法的建立为兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测提供了有力的技术支撑。 展开更多
关键词 兔 f型多杀性巴氏杆菌 fcbD基因 LAMP快速检测方法
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