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猪瘟病毒E^(rns)和E2基因在昆虫细胞中的表达研究 被引量：8
1
作者 韩建强 信爱国 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期23-27,共5页
利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于... 利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBac HT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及Western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白. 展开更多
关键词 猪瘟病毒 erns基因 E2基因 杆状病毒表达系统
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针对猪瘟病毒Erns基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：1
2
作者 王树茂 王桂花 +7 位作者 王安冉 周艳君 姜一峰 乔思娜 赵款 童光志 李丽薇 高飞 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2023年第12期1488-1494,共7页
为建立针对猪瘟病毒(CSFV)的快速诊断方法,根据猪瘟病毒石门强毒株(GenBank ID:AF092448.2)已公布的Erns基因序列设计并合成特异性引物及探针,建立针对Erns基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法,验证其特异性、敏感性、重复性,并进行临床样... 为建立针对猪瘟病毒(CSFV)的快速诊断方法,根据猪瘟病毒石门强毒株(GenBank ID:AF092448.2)已公布的Erns基因序列设计并合成特异性引物及探针,建立针对Erns基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法,验证其特异性、敏感性、重复性,并进行临床样品及重组病毒的检测。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品在1×10^(9)~1×10^(2)copies/μL范围内具有很好的线性关系,相关系数为0.99,斜率为-3.661 5,检测下限为1.0×10^(1)copies/μL,与其他能引起相似临床症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于2.925 02%,证实该方法重复性好。本方法适用于临床样品中CSFV抗原核酸的检测,同时也可以用于CSFV在细胞上增殖情况的检测和本实验室构建的表达CSFV Erns基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定及检测,对于临床上CSFV抗原检测、CSF诊断及CSFV的实验室研究有重要意义。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 erns基因 荧光定量PCR
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猪瘟病毒Erns和E2蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
3
作者 张洪亮 郝占武 +6 位作者 林喜平 张志 王凤雪 解倩倩 韩先杰 单虎 温永俊 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第1期76-83,共8页
本研究将CSFV Erns和E2基因的主要抗原区进行克隆,构建pET32a-Erns和pET32aEK-E2重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化,以纯化的rErns、rE2重组蛋白为包被抗原,经条件优化,分别建立CSFV rErns和rE2抗体间接ELISA检测... 本研究将CSFV Erns和E2基因的主要抗原区进行克隆,构建pET32a-Erns和pET32aEK-E2重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化,以纯化的rErns、rE2重组蛋白为包被抗原,经条件优化,分别建立CSFV rErns和rE2抗体间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,分别获得约为47 kDa和42 kDa的重组蛋白,rErns重组蛋白主要在上清液中存在,rE2重组蛋白主要以包涵体形式存在。Western blot结果显示,纯化后的重组蛋白具有良好的免疫原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了Erns蛋白最佳包被量为2.5μg/mL,rE2蛋白最佳包被量为0.625μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为0.25%PVA溶液,HRP标记的兔抗猪IgG二抗最佳稀释度为1∶2000,临界值分别为0.24和0.33。上述方法仅与CSFV阳性血清发生特异性反应,检测敏感性可达到1∶1600,批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%。本研究建立的间接ELISA方法可初步应用于CSFV Erns和E2抗体的检测,鉴别E2亚单位疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,有利于猪瘟净化工作的实施。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 erns基因 E2基因 蛋白表达 间接ELISA
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猪瘟病毒E^(rns)基因的克隆与序列分析 被引量：1
4
作者 王晓燕 张月 +2 位作者 孙娟 兰邹然 单虎 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第1期15-18,共4页
为了解山东地区猪瘟病毒的变异情况,将6份经RT-PCR方法鉴定为猪瘟病毒(CSFV)阳性的山东地区患病猪的病料接种PK-15细胞,分离得到6株猪瘟病毒。对该6株猪瘟病毒的Erns基因主要抗原编码区序列进行了RT-PCR扩增、克隆、测序,并经DNA Star... 为了解山东地区猪瘟病毒的变异情况,将6份经RT-PCR方法鉴定为猪瘟病毒(CSFV)阳性的山东地区患病猪的病料接种PK-15细胞,分离得到6株猪瘟病毒。对该6株猪瘟病毒的Erns基因主要抗原编码区序列进行了RT-PCR扩增、克隆、测序,并经DNA Star软件对测序结果与HCLV疫苗株、Shimen株及Alfort株Erns基因进行比较和分析,构建了CSFV遗传进化树。结果扩增的6株山东CSFV分离株Erns基因同源性为98.5%~100%,与HCLV疫苗株,Shimen株及Aflort株的同源性为82.9%~85.2%;6株CSFV分离株Erns蛋白的同源性为99.1%~100%,与HCLV疫苗株,Shimen株及Aflort株Erns蛋白的同源性分别为88.0%~88.4%和89.4%~89.8%。表明所分离的6株山东CSFV流行毒株的Erns基因发生了较大变异。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 erns基因 序列分析 进化树
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猪瘟兔化弱毒株E^(rns)基因在大肠埃希氏菌中的表达、纯化
5
作者 王丽 杨艳艳 +3 位作者 张红 李清州 李学伍 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2009年第12期121-123,127,共4页
将猪瘟兔化弱毒株Erns基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经PCR和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测,结果表明,融合表达蛋白的分子... 将猪瘟兔化弱毒株Erns基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经PCR和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测,结果表明,融合表达蛋白的分子量约为55kD,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45%。表达蛋白与兔抗CSFV多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用GST亲和层析柱对Erns融合蛋白进行了纯化。 展开更多
关键词 猪瘟兔化弱毒 erns基因 原核表达 纯化 猪瘟
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山东省猪瘟Erns基因系统进化分析与表达模式的研究
6
作者 兰邹然 张月 +3 位作者 楚遵锋 徐淑华 田夫林 王金宝 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期7-11,共5页
采用RT-PCR方法从山东省采集的怀疑携带猪瘟病毒(CSFV)的病料组织中扩增出全长为696bp囊膜糖蛋白ErnscDNA,其编码232个氨基酸的蛋白质,命名为SDCQ。通过构建E^rns蛋白家族系统进化树分析可知,山东省内流行的CS-FV毒株与传统强毒株和疫... 采用RT-PCR方法从山东省采集的怀疑携带猪瘟病毒(CSFV)的病料组织中扩增出全长为696bp囊膜糖蛋白ErnscDNA,其编码232个氨基酸的蛋白质,命名为SDCQ。通过构建E^rns蛋白家族系统进化树分析可知,山东省内流行的CS-FV毒株与传统强毒株和疫苗用毒株在主要抗原编码基因上存在较大差异。将阳性重组表达质粒pPIC9K/E^rns电转化GS115酵母菌,经筛选、鉴定、甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,在培养液上清中检测到了目的蛋白E^rns,大约50kDa。Western Blot显示,E^rns是以同源二聚体的形式存在,且表达产物可以特异性识别CSFV抗体。 展开更多
关键词 猪瘟 erns基因 进化树 表达
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