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多重实时荧光PCR检测三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌方法的建立 被引量：4
1
作者 金玉娟 陈应坚 +2 位作者 刘渠 甘莉萍 杨慧 《中国卫生检验杂志》 北大核心 2013年第1期103-108,共6页
目的:建立一种多重实时荧光PCR同时检测EPEC、EIEC、EHEC三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌的方法。方法:于GenBank数据库中查找三种致泻性大肠埃希菌及志贺菌毒力基因stx1、stx2、eaeA及ipaH基因序列并使用软件进行比对后设计四套引物及探... 目的:建立一种多重实时荧光PCR同时检测EPEC、EIEC、EHEC三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌的方法。方法:于GenBank数据库中查找三种致泻性大肠埃希菌及志贺菌毒力基因stx1、stx2、eaeA及ipaH基因序列并使用软件进行比对后设计四套引物及探针,建立四重实时荧光PCR检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌的方法,并对方法反应体系及反应条件进行优化,对方法的特异性、敏感性及重复性进行分析。结果:显示该方法具有检测灵敏度高、特异性强,结果与细菌培养结果完全一致,均为100%。结论:四重实时荧光PCR检测体系可同时检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌,具有快速、特异性强、灵敏度高等特点,可广泛应用于临床检验、卫生检验、食品检验等领域,对快速有效的实施针对治疗,预防食物中毒,保障公众健康具有重大意义。 展开更多
关键词 实时荧光PCR 致泻性大肠埃希菌 肠致病性大肠埃希菌 肠侵袭性大肠埃希菌 肠出血性大肠埃希菌 志贺菌
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婴幼儿腹泻致泻大肠埃希菌PCR毒力基因检测 被引量：3
2
作者 叶菊莲 占利 +3 位作者 程苏云 罗芸 余昭 王复甦 《中国卫生检验杂志》 CAS 2009年第9期2055-2057,共3页
目的:了解引起2007年浙江省婴幼儿腹泻的致泻性大肠埃希菌EIEC、EPEC、ETEC血清型分布情况及其毒力基因携带状况。方法:将粪便接种到不加新生霉素的EC肉汤中,增菌后用EMB分离培养,可疑菌经生化鉴定后,进行血清学分型;根据不同血清型,以... 目的:了解引起2007年浙江省婴幼儿腹泻的致泻性大肠埃希菌EIEC、EPEC、ETEC血清型分布情况及其毒力基因携带状况。方法:将粪便接种到不加新生霉素的EC肉汤中,增菌后用EMB分离培养,可疑菌经生化鉴定后,进行血清学分型;根据不同血清型,以PCR检测相应的毒力基因。结果:200份腹泻粪便标本中共分离出EIEC 6株、EPEC 25株、ETEC 20株,其检出率分别为3.0%、12.5%、10.0%。其中EIEC侵袭质粒抗原H基因(ipaH)阳性1株,检出率为16.7%(1/6);EPEC束状菌毛A基因(BfpA)阳性9株,检出率为36.0%(9/25),其中携带紧密粘附素(eaeA)的2株,检出率为8.0%(2/25);ETEC耐热肠毒素(ST)阳性1株,检出率为5.0%(1/20),不耐热肠毒素(LT)未检出。结论:我省2007年引起婴幼儿腹泻的主要致泻性大肠埃希菌为携带BfpA毒力基因的O1、O126型EPEC;因此,有必要在传统细菌鉴定的基础上,增加对致泻大肠埃希菌进行PCR毒力基因检测,为进一步确诊和防控致泻大肠埃希菌引起的婴幼儿腹泻提供更有力的实验室依据。 展开更多
关键词 致病性大肠杆菌(epec) 侵袭性大肠杆菌(eIeC) 产肠毒素大肠杆菌(eTeC) 毒力基因
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Intimin及其受体Tir在致病性大肠杆菌致细胞线粒体功能障碍中的作用 被引量：1
3
作者 杨健 王朝莉 冯丽 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第12期1304-1307,共4页
目的探讨致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)外膜蛋白Intimin及其受体Tir在EPEC致HeLa细胞线粒体功能障碍中的作用。方法将EPEC外膜蛋白Intimin及其受体Tir删除株、相应质粒互补株或染色体互补株感染HeLa细胞,用... 目的探讨致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)外膜蛋白Intimin及其受体Tir在EPEC致HeLa细胞线粒体功能障碍中的作用。方法将EPEC外膜蛋白Intimin及其受体Tir删除株、相应质粒互补株或染色体互补株感染HeLa细胞,用线粒体膜电位(Mitochondria membrane potential,MMP)检测试剂JC-1染色细胞线粒体,通过多功能酶标仪检测MMP水平,Western blot检测Intimin的表达及Tir的转位。结果与野生型菌株相比,Eae删除株和Tir删除株感染细胞的MMP功能显著减弱(P<0.05),Eae删除株功能能被质粒表达相应蛋白所互补,Tir删除株不能被质粒表达Tir互补,但可被染色质表达野生型Tir或TirY474S互补,而染色质TirS434A突变株不能引起明显的MMP下降。结论 Intimin和Tir是参与线粒体功能障碍的重要分子;TirS434在线粒体功能障碍中起重要作用。 展开更多
关键词 致病性大肠杆菌 细菌外膜蛋白质类 INTIMIN 受体 线粒体 功能障碍 删除突变
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致病性大肠杆菌espH删除株的构建及其功能鉴定 被引量：1
4
作者 杨健 丁刚强 黄爱龙 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第6期533-539,共7页
目的构建致病性大肠杆菌(EPEC)espH删除株,探讨espH分子的转位、定位以及在A/E损伤中的作用。方法构建自杀质粒pcvd442-△H::kana,通过结合传递、等位交换,抗性筛选获得espH删除株,并对删除株进行PCR鉴定;构建带HA标签的espH表达载体pTr... 目的构建致病性大肠杆菌(EPEC)espH删除株,探讨espH分子的转位、定位以及在A/E损伤中的作用。方法构建自杀质粒pcvd442-△H::kana,通过结合传递、等位交换,抗性筛选获得espH删除株,并对删除株进行PCR鉴定;构建带HA标签的espH表达载体pTrc99a-espH:HA,转化espH删除株,感染HeLa细胞,免疫荧光技术和Western blot检测espH的转位及定位;构建espH和绿色荧光蛋白融合表达质粒p-espH-EGFP,转染HeLa细胞,荧光显微镜观察融合蛋白的分布;用espH删除株感染HeLa、Caco-2和TC-7细胞,分别用荧光显微镜技术、上皮细胞电阻(TER)检测和扫描电镜(SEM)探讨espH在基垫形成、屏障功能障碍和微绒毛脱落损伤中的作用。结果酶切、测序及PCR鉴定表明自杀质粒pcvd442-△H::kana和espH删除株构建正确。espH依赖T3SS转位到宿主细胞,转位后,Western blot检测发现espH主要分布于细胞的可溶性成分,免疫荧光检测发现espH分布于细胞膜基垫形成处,espH与EGFP的融合蛋白分布于细胞膜。感染试验表明,espH删除株可以形成基垫,并造成Caco-2细胞屏障功能障碍和TC-7细胞微绒毛脱落损伤。结论已成功构建了EPECespH删除株。espH是EPEC的一个依赖T3SS转位的效应分子,转位后,蛋白分布于细胞膜基垫形成处,但未发现espH在EPEC基垫形成、屏障功能障碍和微绒毛脱落方面具有重要作用。 展开更多
关键词 致病性大肠杆菌 espH 突变株 功能
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肠致病性大肠埃希菌EspB基因的体外诱导表达研究 被引量：1
5
作者 郑金鑫 刘晓军 +5 位作者 李多云 马桂红 潘伟光 陈重 余治健 邓启文 《深圳中西医结合杂志》 2013年第4期193-196,共4页
目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白。方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。重组质粒pET-28... 目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白。方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。重组质粒pET-28a-EspB经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹试验(Western blot)分析。pET-28a-EspB表达产物再次经纯化,获得的纯化蛋白进一步经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证。结果:经双酶切和测序验证pET-28a-EspB重组质粒构建成功。pET-28a-EspB重组质粒经IPTG诱导后,在诱导表达不同时间点,培养菌液、沉淀和上清中均有良好的蛋白表达。经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证我们获得了纯化的EspB蛋白。结论:体外可成功诱导EPECEspB蛋白稳定高效表达并获得纯化EspB蛋白产物。 展开更多
关键词 肠致病性大肠埃希菌 espB基因 重组质粒 蛋白诱导表达 蛋白质印迹试验
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