将增强的绿色荧光蛋白 ( enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因插在 HCMV( hum ancytom egolovirus)启动子下游 ,构建了表达质粒 p CA13 - e G,用脂质体 L ipofectin介导分别转染 He L a细胞、Vero细胞 ,仅通过细胞传代 ,就获...将增强的绿色荧光蛋白 ( enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因插在 HCMV( hum ancytom egolovirus)启动子下游 ,构建了表达质粒 p CA13 - e G,用脂质体 L ipofectin介导分别转染 He L a细胞、Vero细胞 ,仅通过细胞传代 ,就获得了能稳定高效表达 EGFP的绿色细胞 .比较发现 ,质粒 p CA13 - e G转染后 ,产生能高效表达 EGFP的 He L a细胞其比率高于 Vero细胞 ;EGFP高效表达对 Vero细胞的毒性大于对 He L a细胞的毒性 .本研究表明 ,绿色细胞轮廓清晰 ,由于其特有的性质 ,在用于细胞的形态观察、细胞分裂等研究时会有所作为 .展开更多
载体的构建是建立遗传转化体系的基础。以真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro为基本骨架,构建大豆疫霉菌遗传转化载体,通过限制性内切酶酶切、去磷酸化、连接等基因重组技术,将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP...载体的构建是建立遗传转化体系的基础。以真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro为基本骨架,构建大豆疫霉菌遗传转化载体,通过限制性内切酶酶切、去磷酸化、连接等基因重组技术,将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)基因和来自莴苣霜霉菌(Bremia lactucae)的启动子(ham34)、终止子重组到真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro中,经大肠杆菌转化后对转化子进行了酶切验证,为大豆疫霉菌遗传转化体系的建立提供载体。展开更多
为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP...为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。展开更多
目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行...目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行荧光检测EGFP的表达,采用激光共聚焦显微镜观测器检测荧光特性。结果PCR和DNA测序证实pEGFP质粒结构正确;在倒置荧光显微镜下,转染24h后,部分Hela细胞可见绿色荧光,转染72h时,大约80%Hela细胞内均可见绿色荧光。加入含G418的选择性培养基进行选择性培养,选择荧光较强的Hela细胞经有限稀释,持续筛选及克隆化培养,获得稳定表达绿色荧光的Hela细胞克隆,扩大培养并传至10代以上,将此细胞株命名为Hela-EGFP。激光共聚焦显微镜观察发现:在蓝光(-395nm)激发时,Hela-EGFP细胞绿色荧光激发波长为395nm,最大发射峰为509nm。结论Hela-EGFP细胞株具备稳定表达EGFP的能力,为实时可视化进行宫颈癌侵袭转移机制的研究奠定了基础。展开更多
文摘将增强的绿色荧光蛋白 ( enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因插在 HCMV( hum ancytom egolovirus)启动子下游 ,构建了表达质粒 p CA13 - e G,用脂质体 L ipofectin介导分别转染 He L a细胞、Vero细胞 ,仅通过细胞传代 ,就获得了能稳定高效表达 EGFP的绿色细胞 .比较发现 ,质粒 p CA13 - e G转染后 ,产生能高效表达 EGFP的 He L a细胞其比率高于 Vero细胞 ;EGFP高效表达对 Vero细胞的毒性大于对 He L a细胞的毒性 .本研究表明 ,绿色细胞轮廓清晰 ,由于其特有的性质 ,在用于细胞的形态观察、细胞分裂等研究时会有所作为 .
文摘载体的构建是建立遗传转化体系的基础。以真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro为基本骨架,构建大豆疫霉菌遗传转化载体,通过限制性内切酶酶切、去磷酸化、连接等基因重组技术,将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)基因和来自莴苣霜霉菌(Bremia lactucae)的启动子(ham34)、终止子重组到真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro中,经大肠杆菌转化后对转化子进行了酶切验证,为大豆疫霉菌遗传转化体系的建立提供载体。
文摘为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。
文摘目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行荧光检测EGFP的表达,采用激光共聚焦显微镜观测器检测荧光特性。结果PCR和DNA测序证实pEGFP质粒结构正确;在倒置荧光显微镜下,转染24h后,部分Hela细胞可见绿色荧光,转染72h时,大约80%Hela细胞内均可见绿色荧光。加入含G418的选择性培养基进行选择性培养,选择荧光较强的Hela细胞经有限稀释,持续筛选及克隆化培养,获得稳定表达绿色荧光的Hela细胞克隆,扩大培养并传至10代以上,将此细胞株命名为Hela-EGFP。激光共聚焦显微镜观察发现:在蓝光(-395nm)激发时,Hela-EGFP细胞绿色荧光激发波长为395nm,最大发射峰为509nm。结论Hela-EGFP细胞株具备稳定表达EGFP的能力,为实时可视化进行宫颈癌侵袭转移机制的研究奠定了基础。
